果蝇碱性神经酰胺酶(DaCER)特征化及其在果蝇发育、存活和繁殖中的作用

摘要

神经酰胺酶能够水解神经酰胺生成鞘氨醇和脂肪酸。这些鞘脂质的代谢与多种生物(从酵母到哺乳动物)的细胞反应相关。通过本研究我们证明了果蝇BWA基因所编码的蛋白具有碱性神经酰胺酶的活性，并且这个蛋白在果蝇的鞘脂质代谢、发育、存活和繁殖中发挥重要的作用。以下是本研究获得的主要结果： 1.用人类神经酰胺酶作为关键词在果蝇基因组数据库中进行Blast搜索，我们发现了一个由果蝇洗脑基因(brainwashing，BWA)编码的蛋白与人类神经酰胺酶1(ACER1)、人类神经酰胺酶2(ACER2)和人类神经酰胺酶3(ACER3)的蛋白序列分别具有35％、46％和26％的同源性。运用RT-PCR的方法我们克隆得到了BWA基因的全长cDNA。通过比对还发现，BWA编码的蛋白与其它的碱性神经酰胺酶也具有相同的氨基酸保守区域。用pSORTII软件可以预测到BWA的蛋白产物含有5个假定的跨膜区域，推测BWA编码的蛋白是多跨膜区域神经酰胺酶超家族中的一员。 2.在Tn细胞中过量表达BWA基因能够在pH8.0、C24:1-ceramide作底物的条件下增加神经酰胺酶的活性，这说明BWA编码的蛋白具有神经酰胺酶的活性，因此我们将BWA重新命名为果蝇碱性神经酰胺酶(DaCER)。DaCER酶反应最适温度是35℃。我们还发现DaCER酶反应具有更广的pH范围，其中最佳pH值是8.0。 3.实时定量PCR的分析结果显示，DaCER的mRNA在果蝇卵巢中表达量最高，脑部和中肠其次，在其它部位只有少量的表达。DaCER在果蝇发育过程中蛹期的表达量上调。我们构建表达载体pEGFP-Cl-DaCER，并将它转染HeLa细胞。荧光显微镜观察的结果显示，DaCER分布在细胞的质膜和高尔基复合体上。 4.DaCER的功能失活导致果蝇未成熟期的发育延迟但是寿命和生殖力却显著提高，说明DaCER在果蝇的发育、寿命和繁殖中起重要的作用。 5.由转座子插入造成的DaCER功能的失活导致果蝇体内鞘氨醇和二氢鞘氨醇的水平下降，特别是C16鞘氨醇的水平显著减少。这与MAPP处理的体外实验的结果相一致。经过MAPP72h处理的S2细胞内的C16鞘氨醇的水平也显著的降低，表明DaCER功能的失活对鞘脂质的代谢有改变作用。 6.为了深入研究DaCER表达的下调在体外水平上对细胞的影响，用RNAi的方法将S2细胞中DaCER的表达量下调。实时定量PCR分析结果显示，转染了DaCER特异的双链RNA的S2细胞中，DaCER的mRNA水平显著降低，但是中性神经酰胺酶的表达有少量升高。流式细胞仪对DaCER下调后的S2细胞的细胞周期分析结果则显示DaCER表达量减少后，S期细胞所占的百分比与对照性比没有显著的差别。 总之，碱性神经酰胺酶DaCER在果蝇的鞘脂质代谢、发育、存活和繁殖中发挥重要的作用。

目录

文摘

英文文摘

前言

声明

致谢

第1章 文献综述

1.1鞘脂质研究进展

1.1.1鞘脂质的结构

1.1.2鞘脂质的生物合成途径及相关酶类

1.1.3鞘脂质在细胞反应中的作用

1.2神经酰胺酶研究进展

1.2.1神经酰胺酶的生化特性

1.2.2神经酰胺酶在调节细胞反应中的作用

1.3果蝇鞘脂质代谢研究进展

1.3.1果蝇作为鞘脂质代谢研究材料的优点

1.3.2昆虫和果蝇的鞘脂质代谢

第2章 果蝇BWA基因的克隆及表达

2.1实验材料

2.1.1果蝇品系

2.1.2菌种、细胞系和真核表达系统

2.1.3试剂

2.1.4工具酶

2.1.5仪器设备

2.1.6试剂配制

2.2实验方法

2.2.1总RNA提取

2.2.2甲醛变性电泳检测

2.2.3总RNA浓度及纯度测定

2.2.4 PCR引物设计

2.2.5 cDNA第一链合成

2.2.6 PCR扩增

2.2.7 PCR产物纯化及克隆

2.2.8感受态细胞制备(CaCl2法)

2.2.9连接转化

2.2.10重组杆状病毒转移质粒pFastBacHT-BWA的构建

2.2.11重组Bacmid的获得

2.2.12昆虫细胞培养、转染及重组病毒的感染

2.2.13 SDS-PAGE分析

2.2.10 Western blot分析

2.3结果与分析

2.3.1总RNA提取

2.3.2 BWA基因RT-PCR扩增及序列测定

2.3.3 BWA基因序列分析

2.3.4重组杆状病毒转移载体的构建

2.3.5重组病毒Bacmid获得及重组Bacmid的转染、鉴定

2.3.6 SDS-PAGEA及Western Blot分析

2.4讨论

第3章 BWA蛋白产物的神经酰胺酶活力测定

3.1实验材料

3.1.1真核表达系统

3.1.2试剂及其他

3.1.3试剂配制

3.1.4仪器设备

3.2实验方法

3.2.1 Tn细胞microsomes提取

3.2.2 BCA测定蛋白浓度

3.2.3酶反应底物制备

3.2.4酶反应

3.2.5鞘脂质提取及HPLC分析

3.2.6标准曲线绘制

3.2.7回收率计算

3.3结果与分析

3.3.1 HPLC条件的建立

3.3.2 BWA蛋白产物神经酰胺酶的活力测定

3.3.3 BWA蛋白产物酶反应最适pH值测定

3.3.4果蝇碱性神经酰胺酶最适底物的测定

3.4讨论

第4章 DaCER基因亚细胞定位及表达时相

4.1实验材料

4.1.1真核表达系统

4.1.2果蝇

4.1.3试剂

4.1.4工具酶

4.1.5仪器设备

4.2实验方法

4.2.1融合表达质粒pEGFP-Cl-DaCER的构建

4.2.2 DaCER在HeLa细胞中的亚细胞定位

4.2.3总RNA提取

4.2.4反转录合成cDNA第一链

4.2.5引物设计

4.2.6 Real time-PCR体系建立

4.2.7数据分析

4.3结果与分析

4.3.1 pEGFP-Cl-DaCER重组质粒构建

4.3.2融合蛋白在HeLa细胞中的表达与定位

4.3.3 DaCER基因在果蝇体内的表达时相

4.4讨论

第5章 DaCER对果蝇发育的影响

5.1实验材料

5.1.1果蝇

5.1.2无菌Petri dish-90mm

5.1.3玉米粉培养基

5.2实验方法

5.3结果与分析

5.4讨论

第6章 DaCER对果蝇寿命和繁殖的影响

6.1实验材料

6.2实验方法

6.2.1果蝇处理

6.2.2数据处理

6.3结果与分析

6.4讨论

第7章 DaCER影响果蝇发育、寿命和繁殖机理的研究

7.1实验材料

7.1.1果蝇

7.1.2果蝇细胞

7.1.3试剂

7.1.4试剂配制

7.1.5仪器设备

7.2实验方法

7.2.1 S2细胞复苏和冻存

7.2.2 MAPP处理S2细胞

7.2.2 MTT法测定细胞存活率

7.2.3 HPLC分析MAPP处理的S2细胞的鞘脂质

7.2.4 S2细胞中DaCER基因的RNA干扰

7.2.5 DaCER基因下调后的S2细胞周期的分析

7.3结果与分析

7.3.1 MTT检测MAPP对细胞存活率的影响

7.3.2 MAPP处理对S2细胞鞘氨醇代谢的影响

7.3.3 DaCER失活对果蝇鞘脂质代谢的影响

7.3.4 DaCER失活对S2细胞周期的影响

7.4讨论

第8章总结与讨论

8.1结论与讨论

8.1.1 DaCER基因结构及蛋白功能的初步验证

8.1.2 DaCER的定位及其对果蝇生理功能的影响

8.1.3 DaCER影响果蝇生理功能机理的探究

8.2本论文的创新之处

8.3进一步研究方向

参考文献