植酸酶phyA基因活性中心密码子的改造及基因工程菌培养条件的研究

摘要

采用PCR技术对来源于黑曲霉N25植酸酶phyA基因表达片段进行定点突变,在不改变其所编码氨基酸的情况下,选用毕赤酵母偏爱的密码子对该基因最保守序列中81位和85位的Arg密码子进行同义突变,将突变基因克隆到puc18载体中,经序列测定确认后进一步构建了突变基因phyA<'m>的酵母表达载体pPIC9k-phyA<'m>,同时以未突变phyA基因的酵母表达载体pPIC9k-phyA作为对照,在同等条件下电击转化毕赤酵母,经诱导培养和产物的酶活测定,筛选出突变与未突变高酶活酵母转化子各2株.对这4株酵母转化子进行Southern blotting分析,结果表明phyA基因以单交换方式单拷贝整合到了酵母染色体DNA中;表达产物的SDS-PAGE分析表明,重组酵母中的植酸酶能有效分泌和表达,酶蛋白分子大小为70.15KD.酶活测定结果表明,经密码子优化的突变重组酵母酶活力明显高于未进行优化的重组酵母转化子,经密码子优化的突变重组酵母株PP-NPm-8于麦芽汁培养基中诱导36h后酶活力可达47600U/ml,其活力比未优化重组酵母株PP-NP-2(23667u/ml)提高了约1倍,比该课题组报道的PP-NP-5(22598 u/ml)提高了约1.1倍,连续传10代培养实验证实,该转化子具有良好的遗传稳定性.对突变植酸酶基因工程菌PP-NP<'m>-8的培养条件进行了研究,确定了其最佳培养条件:将种龄为16h的工程菌液体种子,以3﹪接种量接种pH4.5的麦芽汁生长培养基中培养18h后换为pH值为5.0、甲醇终浓度为4﹪的麦芽汁高温浸提液诱导培养36h后该菌株产酶量可达85067U/ml,比未优化培养条件时提高了近一倍,比姚斌等报道的用BMGY/BMMY培养工程菌获得的15656u/ml提高了4.4倍.同时对突变株PP-NP<'m>-8与未突变株PP-NP-5用麦芽汁培养基培养时的培养基成本加以比较,PP-NP-5菌株的培养基成本与酶产量比价为0.0303元/100000U,突变株PP-NP<'m>-8培养基成本与酶产量比价为0.009元/100000U,与PP-NP-5菌株比较,使培养基成本降低了3.35倍,更比用BMGY/BMMY(培养基成本与酶产量比价为1.97104元/100000U)培养基成本降低了218倍,显著降低了生产成本,为基因工程菌的产业化生产奠定了基础.

目录

摘要

一、前言

二、试验材料及仪器

三、试验方法

四、结果

五、讨论

六、结论

致谢

参考文献

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