人肝癌细胞株SMMC-7721中整合蛋白β1亚基过表达上调p27蛋白表达的分子机制研究

摘要

整合蛋白(integrin)是一类重要的细胞表面粘附分子，可以调节许多基本的细胞功能，例如细胞增殖、分化和凋亡等。一般情况下，整合蛋白通过控制细胞与细胞外基质粘附，促进细胞增殖或抑制细胞凋亡。但是在一些实体肿瘤，例如肝癌中，整合蛋白表达水平通常较低。而且越来越多的实验证据显示，整合蛋白可能参与细胞周期的抑制性调节，但机制尚未明确。我们已有的研究结果发现，在肝癌细胞株SMMC-7721中，整合蛋白α5p1过表达可以抑制细胞增殖并降低此细胞株在裸鼠中的成瘤性。整合蛋白βl亚基过表达可抑制SMMC-7721细胞增殖，并诱导细胞周期阻滞。通过进一步研究发现，此细胞周期阻滞现象与细胞周期抑制性调控蛋白p21和p27的表达密切相关。p21的mRNA和蛋白质表达均上调，进而发现整合蛋白D1亚基过表达可增强p21基因启动子活性。p27的mRNA表达不变，而其蛋白质表达增加，其分子机制不甚明了，可能与p27蛋白质的翻译后调控有关。因此本研究旨在深入探讨整合蛋白对p27蛋白质翻译后调控的机制，以进一步揭示整合蛋白对细胞增殖抑制性调控的分子机制。在实验中，我们首先证实了整合蛋白β1亚基过表达抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖，并且增加了p27的蛋白表达。然后用实时荧光定量PCR方法进一步确认了整合蛋白β1亚基过表达并不影响p27mRNA的表达量，表明整合蛋白β1亚基过表达对p27的调节机制与p21不同。进而我们又发现在整合蛋白β1亚基过表达细胞中，p27蛋白在胞浆和胞核的表达都增加。通过分析p27的蛋白表达与细胞周期的关系，我们还发现整合蛋白β1亚基过表达所引起的p27蛋白表达增加主要发生在细胞周期的G1期。为了明确p27蛋白表达的上调与细胞增殖抑制的关系，我们用RNA干扰技术抑制p27蛋白质的表达，然后观察对细胞增殖的影响。结果发现p27蛋白表达的下调可以恢复细胞的增殖能力，这结果表明p27蛋白表达的增加参与了整合蛋白β1亚基过表达所引起的细胞生长抑制。 进一步研究发现，整合蛋白β1亚基过表达可以延长p27蛋白的半衰期，增加p27蛋白的稳定性，表明整合蛋白β1亚基过表达可以在翻译后水平调节p27蛋白的表达。蛋白酶体参与了SMMC-7721细胞中p27蛋白质的降解。而整合蛋白β1亚基过表达可以通过下调Skp2的mRNA表达、p27Thrl87的磷酸化及p27蛋白的多聚泛素化水平，从而抑制蛋白酶体依赖的降解，导致细胞核内p27的蛋白表达增加。整合蛋白Bl亚基过表达通过抑制P13K信号通路实现对Skp2依赖的p27蛋白质降解调节。而P13K的下游效应分子PKB的活性变化只调节p27蛋白在细胞胞浆、胞核的分布，并不改变p27的蛋白表达量。PKB活性增加使p27蛋白滞留胞浆，反之，PKB活性下降导致p27蛋白入核增多。这结果提示我们：1)整合蛋白D1亚基过表达细胞中PKB活性的下降，也是导致p27蛋白在核内分布增加的原因；2)P13K可能通过其它的下游信号分子调节Skp2介导的p27蛋白质的降解。 但Skp2依赖的p27降解途径的抑制及PKB活性的下降都只导致p27在核内的蛋白表达增加。我们进一步研究发现了钙蛋白酶(calpain)也可以参与SMMC-7721细胞中p27蛋白的降解。在整合蛋白β1亚基过表达细胞中，钙蛋白酶活性降低，表明整合蛋白β1亚基过表达通过抑制钙蛋白酶介导的p27降解导致细胞胞浆中p27的蛋白表达增加。 蛋白酶体和钙蛋白酶都可以介导SMMC-7721细胞中p27蛋白质的降解。Skp2依赖的蛋白酶体途径主要发生在细胞核内，而钙蛋白酶介导的p27降解主要发生在胞浆中。我们通过研究发现，这两条途径都发生在细胞周期的G1期，而钙蛋白酶介导的p27蛋白质降解可能发生在蛋白酶体途径之前。 综上所述，蛋白酶体和钙蛋白酶共同协调介导了SMMC-7721细胞中p27蛋白的降解。而整合蛋白β1亚基过表达正是通过抑制这两种降解机制，导致了SMMC-7721细胞中p27蛋白表达的上调。整合蛋白βl亚基过表达还通过抑制PKB的活性，导致p27蛋白在细胞核内分布增加。总之，整合蛋白β1亚基过表达从蛋白质降解和蛋白质在细胞胞浆、胞核的分布两方面调控p27，从而抑制SMMC-7721细胞的增殖。

目录

缩略词表

引言

第一部分整合蛋白β1亚基过表达对细胞周期负调控蛋白p27Kipl的调节

第二部分整合蛋白β1亚基过表达上调p27Kip1蛋白表达的分子机制——蛋白酶体介导的p27蛋白质降解

第三部分整合蛋白β1亚基过表达上调p27Kip1蛋白表达的分子机制——PI3K/PKB信号通路

第四部分整合蛋白β1亚基过表达上调p27Kip1蛋白表达的分子机制——钙蛋白酶介导的p27蛋白质降解

总结

综述细胞周期负调控蛋白——p27Kip1

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