文昌鱼和斑马鱼agat、gamt和ct1的克隆、进化学分析、表达图式及斑马鱼gamt的功能研究

摘要

头索动物文昌鱼代表着从无脊椎动物到脊椎动物进化过程中一个重要的过渡阶段，被认为是现存的与脊椎动物最接近的无脊椎动物。以文昌鱼为模式动物研究脊椎动物发育的机制是比较胚胎学和发育生物学的重要内容。随着佛罗里达文昌鱼的全基因组测序的完成，必将使文昌鱼在发育分子生物学和基因组进化学的研究中发挥更加重要的作用。 斑马鱼高繁殖力、胚胎体外发育和透明性等优点，使其成为研究胚胎发育的绝佳材料。斑马鱼大规模遗传突变筛选显示，斑马鱼的很多突变表型与与人类相关疾病的临床症状有着相似的特征；基因组测序的数据也已经揭示，斑马鱼的这些基因与引起人类疾病的相应的基因有着极高的同源性。因此，斑马鱼这一模式动物也日益成为研究脊椎动物生物学、生理学和人类疾病最有力的工具。 肌酸(Cr)/磷酸肌酸(PCr)/肌酸激酶(CK)系统是脊椎动物体内能量供应的最重要的机制之一。体内肌酸的合成经两步酶促反应完成，第一步是精氨酸和甘氨酸在精氨酸甘氨酸转氨酶(AGAT)的催化下，合成胍基乙酸和鸟氨酸，第二步是胍乙酸(GAA)和S．腺甘甲硫氨酸(SAM)经胍基乙酸甲基转移酶(GAMT)的催化生成肌酸。肌肉等组织细胞自身不能合成肌酸，必须通过特殊的钠离子依赖的细胞膜肌酸转运蛋白(CT1)摄取血液中的肌酸。根据C玳谢途径可以看出，Cr合成的异常和转运的异常都可以引起肌酸缺陷综合症(CDS)。AGAT，GAMT和CT1缺陷症的病人共同的症状是幼年的神经学上的症状和严重的神经发育延滞。AGAT和GAMT缺陷症可以通过口服肌酸而缓慢的补充脑中肌酸，进而得到治疗。但口服肌酸不能补充CT1缺陷症病人中枢神经系统(CNS)中的缺失的肌酸。尽管服用肌酸可以使AGAT和GAMT缺陷症的病人发育得到恢复，但其仍然遗留脑的发育和智力的障碍。GAMT缺陷症可能是由CNS中堆积的GAA的毒性引起的。 本研究首次克隆到文昌鱼gamt基因(DQl74309)的全长cDNA，共1 542bp。演绎的文昌鱼GAMT蛋白质由236个氨基酸组成，理论分子量为26．8616kDa，预测的蛋白质的等电点为5．20。文昌鱼gamt基因由5个外显子组成。 GAMT进化树与AGAT进化树比较类似。佛罗里达文昌鱼中的一个拷贝GAMT 924与白氏文昌鱼GAMT构成一支，佛罗里达GAMT另一拷贝399独立一支。斑马鱼GAMT也位于脊椎动物一支的顶端，但是与爪蟾GAMT共同组成一亚支。 文昌鱼gamt的表达模式无论在时间上还是空间上都与agat有着高度的一致性。囊胚期以前gamt不表达，最早的表达出现在原肠中期的整个中内胚层。随后gamt开始特异的表达在预定体节中胚层和随后的肌节中，一直持续到刀形幼虫。此外，消化道上皮细胞也检测到gamt的少量表达。与agat的表达不同的是，从表达强度来看，文昌鱼gamt在肌节中的表达在各个时期都比agat强：从表达的广度来看，gamt的表达要更广泛一些，除了肌节，在消化道中也检测到gamt的微弱表达。 本研究首次克隆到白氏文昌鱼ctl基因的426bp的片段。并对佛罗里达文昌鱼ctl基因演绎的CTl蛋白质进行了预测和分析。演绎的文昌鱼CTl蛋白质由631个氨基酸组成，理论分子量为70.7913kDa，预测的蛋白质的等电点为5.06。文昌鱼ctl基因由13或14个外显子组成。 CTl进化树与AGAT和GAMT不同。佛罗里达文昌鱼CTl为树根，白氏文昌鱼CTl和斑马鱼CTl共同组成一支。即斑马鱼CTl与白氏文昌鱼同源性比与其他脊椎动物更高，或者说白氏文昌鱼与斑马鱼的同源性比与佛罗里达文昌鱼更高。 文昌鱼ctl的表达与agat和gamt有很大差异。从卵裂期到囊胚期，ctl具有较强的表达。原肠中期时，ctl的表达略有降低，并限制在整个中内胚层。早神经胚开始，ctl的表达上调，表达在预定脊索中胚层、预定体节中胚层和内胚层中。随后，xt1表达在肌节、形成中的脊索和消化道中。在形成的脊索中，ct1表达消失。晚神经胚和刀形幼虫中表达持续的出现在肌节和消化道中。文昌鱼发育过程中肌酸合成的部位主要是体节(包括预定体节中胚层)。转运的部位比较广泛，包括体节(含预定体节中胚层)、形成中的脊索(包括预定脊索中胚层)以及消化道(包括内胚层)。3个基因都在体节(包括预定体节中胚层)中表达，但3个基因在外胚层都不表达。ct1表达的部位最广，gamt次之，agat最少。ct1表达在体节、消化道和脊索中；gamt表达在体节和消化道(尽管较弱)中，而agat只表达在体节中。 成体文昌鱼中，agat、gamt和ct1的表达有几个特点。第一，agat和gamt的表达区域有很高的一致性。二者都表达在神经索、真皮、咽上沟、原肾管、腮上皮、肠上皮、内柱和卵细胞包膜中。第二，ct1的表达部位较少，只出现在肠上皮和咽上沟(较弱)中。第三，在肌肉、脊索和表皮中，3个基因都不表达。 斑马鱼agat由8个外显子组成。演绎的斑马鱼AGAT蛋白质由422个氨基酸组成，理论分子量为48.0668kDa，蛋白质的等电点为8.03。agat在基因组上只有1个拷贝，位于18号染色体上。 agat在斑马鱼胚胎发育过程中具有动态的表达图式如下：受精卵到囊胚期agat不表达。原肠期开始，agat开始出现在卵黄合胞体层(YSL)。早体节开始，agat在YSL表达加强，同时开始低水平的出现在形成了的体节中。随着胚胎进一步发育，agat-直强烈表达在YSL且微弱的表达在体节中。但48hp时，体节[}1agat消失，但强烈的表达出现在肝脏中。 成体斑马鱼中agat强烈表达在小肠和卵巢中。agat不表达和弱表达的部位包括视网膜、晶状体、心脏、小肠(粘膜上皮、固有膜)、肝脏和胰腺。 成体斑马鱼中ctl强表达的部位较多，包括视网膜、晶状体、心脏、小肠、胰腺、卵巢。ctl不表达的部位较少，只有晶状体纤维、肝脏和小肠固有膜。 斑马鱼agat、gamt和ctl基因在发育过程中的表达有几个规律。首先，ctl在卵黄、YSL和肝脏中一直没有表达，而agat/gamt则都表达在YSL和肝脏(gamt还表达在卵黄中)。其次，ctl在CNS中有表达，而agat/gamt则未检测到CNS的表达。最后，ctl表达在所有的体节(新形成和已经形成的)中，agat/gamt只表达在已经形成的体节中。 与大鼠胚胎发育中3个同源基因的表达模式相比，我们发现，斑马鱼和大鼠agat、gamt和ctl基因在发育中的表达图式有很多相似的地方。例如，3个基因在2个物种胚胎的骨骼肌中都表达，agat和gamt在肝脏中都表达。当然2个物种的基因表达图式也有很多不同点。比如，大鼠胚胎中3个基因都在CNS中表达，而斑马鱼胚胎中只有ctl在CNS中表达：大鼠agat强烈的表达在胚胎的肾脏和胰腺，但斑马鱼胚胎的同源器官中未检测到agat的表达。3个肌酸代谢相关基因中，ctl的时空表达在大鼠和斑马鱼中的保守性最强，暗示着在鱼类和哺乳动物之间可能存在着相似的Cr转运机制。成体斑马鱼中agat、gamt和ctl的表达模式与成体哺乳动物中的同源基因的表达相比，有同有异。相同点如下：agat在脑、肝脏和胰腺中都表达；gamt在肝脏和胰腺中都表达，ctl在心脏和小肠中都表达而在肝脏中都不表达。不同点是，agat在哺乳动物的肝脏和胰腺中高表达，而在斑马鱼中相应器官的表达非常弱，gamt在哺乳动物心肌中低表达或者不表达，但在斑马鱼心肌中表达却很强，ctl在哺乳动物胰腺中低表达或者不表达，但是在斑马鱼胰腺中表达却很强。 斑马鱼gamt基因的dsRNA导入斑马鱼受精卵后，胚胎发育到24小时后出现了3种类型的异常，胚胎的活动能力受到严重的影响。表明gamt基因对斑马鱼胚胎的正常发育以及活动能力都有十分重要的作用。 虽然已有关于文昌鱼和斑马鱼肌酸的报道，但对于它们体内肌酸的来源，学术界却一直都有争议。是来自环境或者食物中，还是它们也具有高等脊椎动物中的内源合成的机制，一直没有定论。本文对agat、gamt和ctl的研究证实，在文昌鱼和斑马鱼中确实存在着与哺乳动物中类似的Cr合成和转运系统，回答了长久以来人们对无脊椎动物和低等脊椎动物中肌酸来源的疑问。由于文昌鱼在进化上的特殊地位，本文对文昌鱼agat、gamt和ctl的研究还将为肌酸代谢途径的进化以及人类肌酸缺陷综合症(CDS)的起源提供一定的线索。本文对斑马鱼agat、gamt和ctl的研究证实，鱼类的cr合成与转运机制(特别是cr转运系统)，与哺乳动物之间存在着很高的相似性。因此，对斑马鱼agat、gamt和ctl的进一步的研究，将为人类CDS致病机理的研究提供新的模型，并为CDS的诊断和治疗提供新的依据。

目录

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摘要

符号说明

第一部分肌酸合成与转运相关基因的研究进展

1肌酸的生物学作用

2脊椎动物肌酸代谢的途径

2.1肌酸的合成与转运

2.2从Cr到PCr

2.3脊椎动物Cr和PCr的降解

3肌酸缺陷综合症

3.1临床症状

3.2生化和分子水平的诊断

3.3治疗方案

3.4 GAMT-D

4肌酸代谢涉及到的几个蛋白质AGAT、GAMT、CT1和CK

4.1 AGAT研究进展

4.2 GAMT研究进展

4.3 CT1研究进展

4.4 CK研究进展

5肌酸在胚胎发育中的作用

6无脊椎和低等脊椎动物中能量代谢和肌酸代谢途径的研究进展

第二部分文昌鱼3个肌酸代谢相关基因的克隆、进化学分析和表达研究

1前言

1.1文昌鱼与发育分子生物学

1.2文昌鱼与比较基因组学

2材料和方法

2.1全长的gamt基因的克隆

2.2 agat和ct1基因的克隆

2.3佛罗里达文昌鱼agat、gamt和ct1的基因组测序分析

2.4演绎的文昌鱼AGAT、GAMT和CT1蛋白质同源性比对以及进化学分析

2.5文昌鱼agat、gamt和ct1胚胎各个发育时期的表达：胚胎整体原位杂交

2.6文昌鱼agat、gamt和ct1在成体各个组织中的表达：切片原位杂交

2.7文昌鱼GAMT在成体组织中的免疫组织化学研究

3结果

3.1文昌鱼agat、gamt和ct1的基因序列和演绎的蛋白质分析

3.2佛罗里达文昌鱼agat、gamt和ct1的基因组测序分析

3.3文昌鱼(以及斑马鱼)AGAT、GAMT和CT1的进化学分析

3.4文昌鱼agat、gamt和ct1在胚胎各个发育时期的表达

3.5 agat、gamt和ct1在成体文昌鱼各个组织中的表达

4讨论

4.1文昌鱼发育过程中肌酸的合成与转运

4.2成体文昌鱼中肌酸的合成与转运

4.3 agat、gamt和ct1在文昌鱼发育过程中与成体中表达的比较

4.4 agat、gamt和ct1在文昌鱼和大鼠发育过程中表达的比较

4.5 agat、gamt和ct1在成体文昌鱼和哺乳动物中表达的比较

第三部分斑马鱼3个肌酸代谢相关基因的克隆和表达研究

1前言

1.1斑马鱼的特点和优势

1.2斑马鱼与发育生物学

1.3斑马鱼与人类疾病研究

2材料和方法

2.1斑马鱼agat、gamt和ct1的克隆和进化学分析

2.2斑马鱼agat、gamt和ct1在斑马鱼胚胎各个发育时期的表达：整体原位杂交

2.3斑马鱼agat、gamt和ct1在成体斑马鱼各个组织中的表达：切片原位杂交

2.4斑马鱼GAMT的免疫组化

3结果

3.1斑马鱼agat、gamt和ct1基因和演绎的蛋白质分析

3.2斑马鱼agat、gamt和ct1在胚胎各个发育时期的表达

3.3斑马鱼agat、gamt和ct1在成体斑马鱼各个组织中的表达

3.4斑马鱼GAMT蛋白质在成体组织中免疫组织化学的结果

4讨论

4.1斑马鱼发育过程中肌酸的合成与转运

4.2成体斑马鱼中肌酸的合成与转运

4.3斑马鱼agat、gamt和ct1在发育过程中与成体的比较

4.4斑马鱼肌酸合成与转运途径的进化地位

第四部分RNAi技术对gamt基因在斑马鱼胚胎发育过程中功能的初步研究

1前言

1.1 RNAi的分子机制

1.2 RNAi实验设计

1.3 RNAi的应用前景

1.4斑马鱼中dsRNA的研究进展

2材料和方法

2.1 gamt dsRNA的合成

2.2显微注射

3结果

4讨论

总结

参考文献

攻读学位期间完成的工作

致谢