人乳腺癌细胞中β-arrestin2对阿片受体介导的细胞凋亡及Toll样受体信号传导途径调控的研究

摘要

研究背景： 本研究拟以人乳腺癌细胞株为研究目标，第一部分观察了阿片类药物吗啡对的肿瘤细胞增殖和凋亡的调控，以及其对肿瘤细胞内β-arrestins表达的调节。发现大剂量的吗啡能介导细胞凋亡。第二部分，进一步分析了β-arrestin2在阿片类药物引起的肿瘤细胞凋亡中的作用，以及其主要信号传导途径。β-arrestin2还可能是GPCR、TLRs和凋亡途径的一个连接子，作用于TLRs途径中的多个信号分子，激发肿瘤细胞的炎症反应和免疫。在论文的第三部分，分别干扰了人乳腺癌细胞中β-arrestin2和MyD88的表达，来检测TLRs信号传导通路中相关的蛋白的变化，探讨人乳腺癌细胞中β-arrestin2对TLRs信号传导通路的相互作用及其分子机制。 第一部分：吗啡对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响以及G蛋白偶联受体调节蛋白β-arrestins表达影响的研究 目的：研究和分析阿片类药物吗啡对人乳腺癌细胞株增殖和凋亡的影响，以及吗啡介导的细胞增殖和凋亡中β-arrestins表达的改变。 方法： 不同浓度吗啡作用于人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231细胞不同时间阶段。台盼蓝染色法检测测定吗啡对人乳腺癌细胞增殖活性的作用；利用流式细胞仪检测吗啡对人乳腺癌细胞的细胞周期和凋亡的影响及Caspase家族活性变化；利用RT-PCR技术和Westernblot方法分别从分子水平和蛋白水平研究吗啡介导的人乳腺癌细胞增殖和凋亡过程中β-arrestins表达的改变，探讨吗啡对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响以及对β-arrestins表达的影响。 结果： 1.低浓度吗啡时对人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231细胞增殖有促进作用。高浓度或大剂量吗啡能够有效抑制体外培养的人乳腺癌细胞株细胞的增殖活性，并呈现时间和剂量依赖关系。 2.Nx和吗啡1:1联合作用于细胞，≥250μM时，MCF-7的细胞存活率明显的升高，但在MDA-MB231细胞中作用不明显。 3.吗啡可以诱导人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231细胞发生细胞周期阻滞，细胞主要被阻滞于G1期；并且，这种细胞周期阻滞效应存在剂量依赖性。 4.吗啡可以诱导人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231细胞发生凋亡，并且随着作用时间的延长、细胞凋亡率增加，而且细胞凋亡率随药物浓度增大而增加。 5.在吗啡诱导人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231细胞发生凋亡的过程中Caspase-3和Caspase-8均被激活，二者的活性均随着作用时间延长而增加。 6.β-arrestin1和β-arrestin2在人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231内均高表达。吗啡可以明显降低MCF-7和MDA-MB231细胞内β-arrestin2mRNA和蛋白的表达，但对β-arrestin1影响不明显。随着吗啡作用时间延长β-arrestin2蛋白和mRNA的表达水平均下降，而β-arrestin1蛋白及其mRNA的表达水平无明显改变。 结论： 吗啡作为一种阿片类药物，不仅可以抑制体外培养的人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231细胞的增殖活性、引起细胞周期阻滞，还可诱导细胞发生凋亡；Caspase-3和Caspase-8引导的信号通路均参与了吗啡诱导的人乳腺癌细胞凋亡。体外实验乳腺癌MCF-7细胞中，Nx是一种有效的吗啡拮抗剂。吗啡可以通过降低β-arrestin2的mRNA和蛋白表达，从而在凋亡过程中发挥着重要作用。而β-arrestin1的mRNA和蛋白表达变化不明显，β-arrestin1在此过程中可能不发挥作用。 第二部分：人乳腺癌细胞中β-arrestin2对阿片受体介导的细胞凋亡的调节作用及其信号转导机制探讨 目的：研究和分析β-arrestin2在阿片类药物引起的肿瘤细胞凋亡中的作用，以及其主要信号传导途径。 方法： 人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231细胞分别转染β-arrestin2iRNA和全长β-arrestin2质粒后，荧光显微镜观察和RT-PCR分析转染率，细胞转染率达85～95％。使用不同浓度吗啡作用于转染细胞不同时间阶段，台盼蓝染色法和MTT细胞存活率分析分别检测β-arrestin2在吗啡介导的人乳腺癌细胞凋亡和增殖中的作用；细胞转染48小时后，加入2mM吗啡孵育3小时后收集细胞，westernblot分析Akt、Caspase-3、Caspase-8、p53蛋白表达的改变。野生型和β-arrestin2缺失的鼠胚胎成纤维细胞MEF进一步证实结果。 结果： 1.β-arrestin2干扰后，当吗啡浓度≥500μM时，MCF-7和MDA-MB231细胞增殖率明显降低。 2.当吗啡浓度≥250μM时，β-arrestin2干扰后导致了MCF-7和MDA-MB231细胞死亡率明显升高。 3.与只有β-arrestin2抑制或吗啡处理组相比，β-arrestin2抑制后吗啡处理组的磷酸化Akt表达明显降低。 4.与只有β-arrestin2干扰后或吗啡处理组相比，β-arrestin2抑制后吗啡处理组的Caspase-3和Caspase-8激活片段的表达明显升高。 5.与只有β-arrestin2抑制或吗啡处理组相比，β-arrestin2抑制后吗啡处理组的磷酸化p53的表达明显升高。 6.barr2-/-MEF细胞得到相同结果。 结论： 1.β-arrestin2在人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231中明显的抑制了吗啡介导的细胞凋亡。 2.首次证明了β-arrestin2通过增强抗凋亡蛋白Akt的表达和抑制促凋亡蛋白P53、Caspase-3和Caspase-8途径来参与吗啡介导的细胞凋亡信号传导通路。 第三部分：人乳腺癌细胞中β-arrestin2对MyD88依赖性Toll样受体信号传导途径的负向调节作用及其机制研究 目的：研究和分析人乳腺癌细胞中，β-arrestin2对TLRs信号传导通路的调节作用。 方法： 人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231细胞转染β-arrestin2iRNA质粒后，荧光显微镜观察和RT-PCR技术分析转染率，细胞转染率达85～95％。细胞转染不同时间后，使用RT-PCR技术分析TLR2、TLR4、TRAF6、Mal、MyD88基因mRNA表达水平的改变。野生型和β-arrestin2缺失的鼠胚胎成纤维细胞MEF进一步证实结果。MCF-7和MDA-MB231细胞分别转染DN-MyD88和MyD88-GFP质粒后，荧光显微镜观察和RT-PCR技术分析转染率，细胞转染率达85~95％。细胞转染不同时间后，使用RT-PCR技术分析TLR2、TLR4、β-arrestin1、β-arrestin2、Mal基因mRNA表达水平的改变。 结果： 1.MCF-7和MDA-MB231细胞中，β-arrestin2抑制后TLR2，Mal、MyD88基因mRNA表达上调，但TLR4基因mRNA表达无明显改变。 2.MyD88抑制后，TLR2、TLR4、β-arrestinl、β-arrestin2、Mal基因mRNA表达上调，但在MCF-7细胞中TLR4基因mRNA表达改变不明显，在MDA-MB231细胞中Mal基因mRNA表达改变不明显。 3.barr2-/-MEF细胞中，β-arrestin2抑制后TLR2、TLR4、Mal、MyD88基因mRNA表达上调；MyD88抑制后，TLR2、TLR4、β-arrestin1、β-arrestin2、Mal基因mRNA表达上调。 结论： 1.TLR2、TLR4、MyD88、Traf6和Mal基因在乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB231细胞中均表达。 2.β-arrestin2与TLRs信号途径基因TLR2、TLR4、MyD88、Mal和TRAF6相互作用。 3.β-arrestin2负调节MyD88依赖TLRs信号传导途径基因的表达. 4.β-arrestin2作为一个桥梁连接GPCR和TLRs信号途径。 研究意义：本课题通过观察阿片类药物吗啡对人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231增殖和细胞凋亡的影响，首次证明了β-arrestin2主要通过抑制Akt抗凋亡信号和激活P53、Caspase-3和Caspase-8凋亡信号来参与吗啡介导的细胞凋亡信号传导通路的。这一概念的提出进一步的证实了β-arrestin2是一个抗凋亡分子，质疑目前少数观点认为的β-arrestin2促凋亡观点。这为乳腺癌诊断和治疗提供提供新的思路和技术平台。此外，β-arrestins作为一个多功能的受体分子和骨架蛋白不仅能作用于GPCRs信号传导通路，还能TLRs信号相互作用激活基因。对于β-arrestin2与TLRs信号传导途径及该途径中主要信号分子的相互作用的研究，促使我们进一步认识了β-arrestins的非凋亡效应，即促炎症效应，从而为恶性肿瘤的免疫治疗提供新的理论基础，对选定特定的靶分子或符合受体将是一个恶性肿瘤治疗上的突破。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一部分：吗啡对人乳腺癌细胞细胞增殖和凋亡的影响以及对G蛋白偶联受体β-arrestins影响的研究

前 言

实验目的

材料和方法

结 果

讨 论

结 论

附 图

附 表

参考文献

第二部分：人乳腺癌细胞中β-arrestin2对阿片受体介导的细胞凋亡的调节作用及其信号转导机制探讨

前 言

实验目的

材料和方法

结 果

讨 论

结 论

附 图

附 表

参考文献

第三部分：人乳腺癌细胞中β-arrestin2对MyD88依赖性Toll样受体信号传导途径的负向调节作用及其机制研究

前 言

实验目的

材料和方法

结 果

讨 论

结 论

附 图

参考文献

致 谢

攻读学位期间发表的学术论文

发表论文1

发表论文2