山羊BLG调控序列及CMV增强子指导人胰岛素原基因在细胞和小鼠中表达

摘要

糖尿病是一种以胰岛素缺乏及高血糖为主要特征的自身免疫性疾病。目前治疗除注射外源性胰岛素外，尚无其他切实有效的方法。近年来，随着转基因技术的发展，利用转基因技术生产人胰岛素的方法是目前研究的热点。 本实验室已经用人胰岛素原基因组DNA与山羊乳蛋白调控序列、增强子序列以及新霉素抗性基因构建了人胰岛素原基因乳腺特异性表达载体BIC13。本课题利用该表达载体在细胞和动物水平上的表达特性，来验证其在乳腺生物反应器上生产的可行性。 本试验采用电穿孔方法将人胰岛素原基因乳腺特异性表达载体片段导入奶山羊乳腺上皮细胞，经含400μg/ml G418的筛选培养液筛选培养两周，得到有抗性的细胞株。挑取单克隆株进行扩大培养后。提取其细胞基因组，经PCR检测后，对阳．性细胞株用催乳素诱导表达，48小时后提取细胞诱导液，用ELISA法检测诱导液中的胰岛素原。结果获得6株表达的阳性细胞株。 本试验采用显微注射的方法将人胰岛素原乳腺特异性表达载体片段注射入小鼠受精卵的雄原核，对出生的小鼠经PCR整合检测后，对筛选到的阳性小鼠用ELISA法检测其乳汁及血液中胰岛素原。本次试验共注射632枚受精卵，存活471枚卵。产仔43只。通过PCR整合检测，获得一只转基因阳性小鼠(编号＃6)，对其乳汁和血液的ELISA检测表明该构件可在小鼠乳腺中表达并具有乳腺特异性。 因此，本实验室构建的人胰岛素原基因乳腺特异性表达载体不仅能有效的指导人胰岛素原在山羊乳腺上皮细胞和小鼠乳腺中的表达，而且具有乳腺组织特异性。可以用于动物乳腺生物反应器的研制。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

第一章综述

第二章建立表达人胰岛素原基因的乳腺上皮细胞系

1材料

1.1主要材料

1.2实验器材与仪器设备

1.3主要试剂

1.4有关试剂的配制

2方法

2.1细胞的培养及纯化

2.2阳性克隆细胞株的建立

2.3阳性细胞株的PCR检测

2.4整合外源基因的细胞的诱导表达及ELISA检测

3结果

3.1乳腺上皮细胞原代培养

3.2细胞转染

3.3阳性细胞的PCR检测

3.4细胞上清液ELISA检测

4讨论

第三章转基因小鼠的制备及整合检测与表达检测

1材料

1.1试验动物来源

1.2仪器

1.3主要药品与试剂

2方法

2.1转基因小鼠的制备

2.2转基因小鼠的整合检测

2.3阳性转基因小鼠的表达检测

3结果

3.1显微注射的结果

3.2阳性转基因小鼠PCR检测结果

3.3阳性转基因小鼠乳样ELISA结果

3.4阳性转基因小鼠血清ELISA结果

4讨论

结论

参考文献

致谢