草鱼野生和养殖群体间遗传结构比较研究

摘要

草鱼(Ctenopharyngodon idella)属于鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，雅罗鱼亚科(Leuciscinae)，因其草食性、生长快、肉质鲜美等特点，是优良的淡水养殖品种。由于人工繁殖的成功应用，改善了种苗供应不足的状况，也使很多地方引种后建立了独自的繁殖小群体。受生产条件和生产规模的限制，生产单位保存的亲鱼数量不多，且大部分选自自繁后代，如此经过多年的生殖隔离和多代近交，引起了养殖性状不同程度的退化，如性早熟、成熟个体趋小、抗病力降低等。 在群体遗传学的研究中，利用不同DNA标记在不同群体出现的频率，预测群体间的遗传分化已成为一个热门研究课题。但在草鱼的研究中，尚未见用不同分子标记各等位基因出现频率的差异，研究野生和养殖草鱼种质资源的报道。由于养殖性状的退化和稀有等位基因的丢失以及杂合度的降低密切相关，因此应用大量DNA标记研究人工繁殖条件下，草鱼由于近交产生的杂合度下降和不利突变的积累是一条可行的途径。 本文利用磁珠富集法对草鱼微卫星进行了筛选，然后运用微卫星(microsatellite or simple sequence length polymorphism)重复序列长度多态、TRAP(target region amplified polymorphism)靶位区域扩增多态、SRAP(sequence-related amplified polymorphism)序列相关扩增多态等标记，从基因组重复序列、表达序列标签以及开放阅读框等不同角度，通过比较草鱼野生群体和养殖群体间等位基因频率的变化，从分子水平揭示养殖群体遗传物质的变化，从而为解决养殖性状的退化提供理论依据，也为将来草鱼遗传图谱构建提供更多的遗传标记。具体研究内容如下： 1草鱼基因组提取及CA重复微卫星富集文库的构建 利用传统酚-氯仿法及试剂盒法对草鱼血液及鳍条基因组提取效果进行比较，结果发现：以血液为试验材料，传统方法抽提效果好于试剂盒法，可能是由于购买的试剂盒适合人血液基因组的缘故；采用传统方法提取草鱼基因组时，血液提取效果好于鳍条。根据生物素(biotin)与链亲和素(strcptavidin)的强亲和性原理，用平端限制性内切酶Mbo I消化草鱼基因组DNA，回收纯化300-1000bp的片段，连接上接头，与生物素标记的微卫星寡核苷酸探针(CA)16退火结合，用链亲和素磁珠(streptavidin magnetic beads)亲和捕捉，获得含有微卫星序列的单链目的片段，经PCR扩增形成双链，然后克隆到pMD18-T载体上，转化至DH5<,α>中，首次成功构建草鱼基因组微卫星富集文库。抽样检测阳性率为69.23％，说明构建的富集文库质量较高，适合大规模测序。2 草鱼野生和养殖群体间遗传变异的微卫星分析 运用微卫星标记对江苏省境内分布的草鱼一个野生群体和两个养殖群体遗传多样性进行分析。在10个座位中，每个座位产生的等位基因数从2到8不等，共产生55个等位基因。邗江草鱼野生群体有效等位基因数、多态信息含量、期望杂合度与平均表观杂合度均最高，依次为3.9、0.5068、0.6939、0.7；无锡前洲草鱼养殖群体最低：2.2、O.1796、0.5235、0.5286；淡水中心草鱼养殖群体各参数均介于两者之间。邗江草鱼野生群体与淡水中心草鱼养殖群体、无锡前洲草鱼养殖群体间遗传距离分别为0.4732和0.4488，大于两个草鱼养殖群体间遗传距0.3090，群体间遗传分化系数也有同样的趋势。结果表明：草鱼野生群体遗传多样性更为丰富，养殖群体存在杂合度降低，遗传多样性下降的现象。遗传多样性所占比例的分析表明，85.01％的遗传变异来自于群体内，14.99％的遗传变异来自于群体间。各座位分化程度的χ<'2>检验结果表明，10个座位中有GMl8、MFWl-1、MFWl-2三个座位群体间分化达到极显著水平。比较各座位在不同群体等位基因频率的变化发现：座位GMl8的7，MFWl-1的1、2，GMO03-1的1、6，GMPO3-2的5，MFW5的1、5，GMl9的1，Ccal2的l、8等一些低频稀有等位基因在养殖群体中丢失，导致其遗传多样性下降，从而降低了适应环境的能力。 3 不同群体草鱼遗传结构的TRAP分析 以草鱼DNA为材料，分析了模板DNA，Mg<'2+>，dNTPs，引物浓度，以及循环参数和退火温度对TRAP-PCR扩增结果的影响，确立了稳定性强重复性好的草鱼TRAP最佳反应体系和PCR扩增参数。结合微卫星标记技术，研究新型分子标TRAP及SSCP在草鱼遗传多样性分析中的适用性。结果表明：对于没有检测到长度多态性的微卫星标记，可以通过TRAP技术，将TRAP随机引物与微卫星引物组合对草鱼基因组扫描，或利用SSCP技术进行构象多态性分析，增加其多态性，寻找更多的草鱼多态性标记。随后应用TRAP技术，针对草鱼基因组表达序列标签(EST)部分，对草鱼以上三个群体间的遗传多样性差异进行了比较。从15个引物组合中，筛选出7个扩增效果比较好的引物组合，在三个群体中共检测到103个扩增位点，其中野生群体、淡水中心群体、前洲群体的多态性位点分别为67、55、46，这表明人工养殖草鱼群体的遗传多样性有所降低。与野生群体相比较发现，人工养殖群体仅33.98％位点的基因频率保持不变，这表明人工养殖群体的遗传结构发生了改变。淡水中心群体、前洲群体与野生群体间的遗传距离分别为：0.0421和0.0809。引物组合Ga5-800-E5扩增的结果发现人工养殖群体中存在扩增位点明显减少的区域，克隆测序这些野生草鱼群体特异序列，进行序列比对发现，有些为调控序列，有些序列功能未知。4 新型标记SRAP在草鱼遗传多样性评价中的适用性分析采用新型分子标SRAP，引物设计针对草鱼基因组中开放阅读框(ORF)，对草鱼三个群体进行进一步的遗传多样性分析。从不同引物组合中筛选出8组条带清晰、多态性丰富的引物组合，不同引物组检测到的位点数12～21不等，在三个草鱼群体中共检测到120个位点，其中多态性位点有92个，多态位点比例为76.67％，显示了较高的多态性。野生群体与人工繁殖群体多态位点比例分别为：67.62％，59.81％，53.33％。3群体的平均杂合度分别为：0.2143、0.2110、O.1722；邗江野生群体与两个人工繁殖群体间的遗传距离分别为：0.0980、0.1159，两个养殖群体间遗传距离为：0.0959。结果表明：人工繁殖群体遗传多样性有所下降。比较各扩增位点显性基因型频率在不同区间的分布发现，人工繁殖群体低频多态位点明显减少，隐性纯合明显增加。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号及缩写汇总

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引言

第一部分文献综述：第一章水产养殖现状及草鱼养殖中存在的问题

第一部分文献综述：第二章群体遗传学及其研究方法

第一部分文献综述：第三章微卫星标记在水产养殖上的应用

第二部分论文实验部分:第一章草鱼基因组提取及(CA)重复微卫星富集文库的构建

第二部分论文实验部分:第二章草鱼野生和养殖群体间遗传变异的微卫星分析

第二部分论文实验部分:第三章草鱼TRAP-PCR反应体系的建立

第二部分论文实验部分:第四章TRAP及SSCP检测草鱼微卫星及相关序列多态性

第二部分论文实验部分:第五章不同群体草鱼遗传结构的TRAP分析

第二部分论文实验部分:第六章新型标记SRAP在草鱼遗传多样性评价的适用性分析

全文结论

附录:实验试剂及配置

攻读学位期间发表论文目录

致谢