猪链球菌的PCR诊断及猪链球菌7型和9型国内分离株的检测

摘要

猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是一种重要的人畜共患病病原，根据菌体荚膜多糖抗原性的不同，分为35个血清型(1-34型，l／2型)。世界范围内以SS2流行最广，致病性最强。国内1991年在广东省首次分离鉴定到SS2，随后于1998年和2005年分别在江苏和四川部分地区暴发人感染SS2并致人死亡，危害严重。 欧美等国家对猪链球菌毒力因子的研究发现菌株有多种基因型，致病性最强的基因型为cps2／epf+／mrp+／sly+。而国内SS2分离株的毒力因子分布情况不很清楚，本实验对国内SS2分离株的毒力因子进行检测。并与国外菌株的毒力因子分布情况进行比较，为建立检测致病性SS2的多重PCR方法提供依据。选取猪链球菌7种主要毒力因子—谷氨酸脱氢酶(gdh)、荚膜多糖(cps)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、纤连蛋白／血纤蛋白原结合蛋白(fpbs)和毒力相关基因orf2，设计与合成7对引物，用PCR方法进行检测。结果显示：25株SS2国内分离株，96％(24／25)表现为cps2／gdh+／epf/mrp+／sly+/fbps+/orf2+，仅l株表现为cps2／gdh+／epf-／mrp+／sly+／fbps+／orf2+。l株SS7国内分离株为cps7／gdh+／epf-／mrp-／sly+／fbps-/orf2+；2株SS9国内分离株均为cps9／gdh+／epf-／mrp-／sly-／fbps-／orf2+，可见国内SS2分离株的基因型比较相似，毒力基因分布特征有特点，提示我国目前SS2的主要流行菌株是同时具有7种毒力因子的高致病菌株。 结合上述毒力因子分布情况，根据SS2的cps2J、mrp、orf2基因(virulent-associate　sequence orf2)设计合成三对引物，建立三重PCR检测方法，并对PCR扩增产物进行测序、酶切、特异性及敏感性实验。结果显示：26株SS2致病菌株(25株国内病猪分离株，l株德国标准参考株)均同时扩增出这三个目的片段，5株其它血清型猪链球菌(SSl，SS7，SS9)及13株非猪链球菌的其它猪源链球菌(兰氏B群，C群和D群)均未扩增出cps2J和mrp段，检测结果与菌株的已知毒力因子背景完全相符。26株SS2的PCR扩增片段经酶切鉴定，与预期结果一致。以SS2四川株ZY05719为模板的三重PCR产物(cps2，mrp,orf2)测序结果与GenBank上相关序列比较，同源性分别为99％、100％、94％，测序结果登录GenBank，登录号分别是cps2J(DQ207606)、mrp(DQ207605)、orf2(DQ207938)。该PCR敏感极限是600CFU。本试验所建立的三重PCR特异性强、敏感性好，可用于实验室猪链球菌2型的快速鉴定，有利于猪链球菌病的监测与控制。为了进一步快速确定猪链球菌2型致病菌株主要毒力因子，本试验根据GenBank发表的猪链球菌gdh、cps2d、mrp及epf殳计并合成四对引物，建立四重PCR检测方法，并对PCR扩增产物进行特异性及敏感性实验。试验结果：25／26的SS2致病菌株可同时扩增出四个目的片段，1株SS2致病菌株缺失epf基因；13株非猪链球菌的阴性对照株均未扩出四个目的片段，上述检测结果与菌株的已知毒力因子背景情况完全相符；敏感极限为500CFU。因此所建立的多重PCR特异性强，敏感性好，适合实验室检测，可辅助临床诊断，有利于疾病的检测与控制。 不同血清型的地区分布不同，除SS2外，SS9主要在德国、比利时、西班牙、荷兰等地流行；芬兰以SS7最为流行。为了解国内是否存在除SS2外的其他猪链球菌，本实验用建立的SSl、SS2、SS7、SS9的PCR方法，对送检可疑菌株进行检测。检测结果结合其序列分析，确定其中一株为血清型7型，命名为SH040805；两株为血清型9型，分别命名为SH040917、JX041226。进一步用PCR方法对其毒力因子进行检测，并进行小鼠致病性实验及药敏实验。结果显示SH040805表现型为cps7／gdh+／epf-／mrp-／sly+／fbps-／orf2+；SH040917及JX041226表现型均为cps9／gdh+／epf-／mrp-／sly／fops-／orf2+。SS2(HA9801)的LD<,50>为2.23；SS7(SH040805)的LD<,50>为2.08；SS9(SH040917)对小鼠不致病。国内猪链球菌分离株均呈多重耐药；尤其SS9耐药性最严重，对磺胺类药物、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类药物高度耐药。综上可知，我国的猪群除ss2外还存在SS7、SS9；其毒力因子分布与国外同种血清型的分离株均不同，且与国内流行的SS2毒力因子分布差异显著。小鼠致病性试验表明SS7国内分离株的致病性很强，仅略低于SS2国内分离株。

目录

文摘

英文文摘

前言

原创性声明及学位论文版权使用授权书

第一篇文献综述 猪链球菌2型的研究进展

第二篇试验部分 第一章猪链球菌2型国内分离株毒力因子的分布特征

第二篇试验部分 第二章猪链球菌2型三重PCR检测方法的建立

第二篇试验部分 第三章检测猪链球菌2型主要毒力因子的多重PCR方法的建立

第二篇试验部分 第四章猪链球菌7型和9型的鉴定

全文总结

致谢