甲型肝炎-乙型肝炎-戊型肝炎三联疫苗的免疫原性研究

摘要

病毒性肝炎(viral heptitis)是由多种肝炎病毒引起的常见传染病,我国是病毒性肝炎的高发区,在法定报告传染病中。病毒性肝炎的发病率占首位。甲型肝炎(hepatitis A,HA)是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的急性病毒性肝炎,通过粪一口途径传播。乙型肝炎(hepatitis B,HB)是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所导致的常见传染病之一,广泛流行于世界各国,我国是HB的高发地区。戊型肝炎(hepatitis E,HE)是一种经粪-口途径传播的急性传染病,在世界各地发展中国家广泛流行,严重危害人类健康。 2000年,中国第一支自主知识产权的HealiveTM甲肝灭活疫苗经历四年研制取得成功。乙型肝炎疫苗已上市多年,大量临床实践证明,是预防乙型肝炎的安全有效措施。目前HEV疫苗尚未最终研制成功,用基因工程手段表达HEV主要结构蛋白作为HEV疫苗已成为研究的主要方向。本实验室以往应用抗原mapping技术和基于PCR的体外中和实验发现HEV的中和抗原表位位于HEV ORF2编码蛋白C端的第452-617位氨基酸之间,在此基础上,采用原核表达系统,表达含有HEV中和抗原表位的p179,动物实验表明,该蛋白可诱导出高滴度的抗-HEV中和抗体,具有良好的免疫原性。 联合疫苗是含有两种或两种以上抗原,能够预防两种或两种以上疾病的疫苗制品。由于各型肝炎病毒之间没有交叉免疫,同一个体可以感染两种或两种以上肝炎病毒。多重肝炎病毒感染较单一病毒感染的病情重,临床愈后较差。因此,研发病毒性肝炎联合疫苗对有效控制病毒性肝炎有重要意义。 董晨在研究甲肝-戊肝联合疫苗时发现联合疫苗诱导小鼠产生的戊肝抗体滴度高于同剂量单价戊肝疫苗,联合疫曲诱导小鼠产生的甲肝抗体滴度不低于同剂量的单价甲肝疫苗,甲肝-戊肝联合疫苗中,甲肝抗原成分可能起一个类似佐剂的作用,能增强戊肝抗原成分的免疫原性；张敏在研究乙肝-戊肝联合疫苗中发现当联合疫苗中乙肝抗原和戊肝抗原浓度合适时,联合疫苗诱导小鼠产生的抗-HBs IgG和抗-HEV IgG不低于同剂量单价乙肝和单价戊肝疫苗。鉴于联合疫苗的诸多优点以及我国HA、HB、HE高度流行,重叠感染率不断增加的现状,开展了实验性甲型肝炎-乙型肝炎-戊型肝炎联合疫苗(甲肝-乙肝-戊肝联合疫苗)的研究,分析三种抗原成分的相互作用以及最佳的剂量配比。本研究主要分为以下两个部分： 一、实验性甲型肝炎灭活疫苗的制备及其免疫原性的研究 用HLF、MRC5、Vero、FRhK-4细胞分别培养HAV(HM175株),不同时间点收获HAV,对收获后的病毒进行感染性滴度和培养周期比较。FRhK-4转瓶培养HAV,经密度梯度离心、灭活、定量,制备实验性甲肝灭活疫苗。不同剂量的实验性甲肝灭活疫苗和不同剂量的市售疫苗HealiveTM免疫小鼠,比较小鼠抗-HAV抗体出现的阳性率和抗体水平,分析实验性甲肝灭活疫苗的免疫原性。 结果显示,HAV接种到FRhK-4细胞培养,两天后出现CPE,至第6天时CPE达到+++。其它3种细胞以及阴性对照瓶均没有出现CPE。HLF、MRC5、Vero培养的HAV分别在第36d、第27d、第21d时病毒产量达到高峰,其病毒感染滴度分别为5.00 logCCID50/0.1ml、7.67 logCCID50/0.1ml、7.00 logCCIDso/0.1ml,FRhK-4细胞培养的HAV第3d感染性滴度为5.33 logCCID50/0.1ml,在第6d达到7.33 kgCCID50/0.1ml。由SDS-PAGE电泳图可知:HAV衣壳蛋白由分子量大约为33KD、29KD、23KD的VP1、VP2、VP3组成。实验性甲肝灭活疫苗512 ELISA Unit(EU)组与市售HealiveTM20Unit(U)组免疫小鼠后,平均抗体水平在第4、6、8周差别均无统计学意义(P>0.05),提示实验性甲肝灭活疫苗具有良好的免疫原性,能使小鼠产生良好的免疫应答,为甲肝-乙肝-戊肝联合疫苗的制备提供了良好的基础。 二、交叉剂量配比的实验性甲型肝炎-乙型肝炎-戊型肝炎三联疫苗的免疫原性研究 采用8种不同剂量配比的实验性甲肝-乙肝-戊肝联合疫苗A512+B2.5+E5、A512+B2.5+E2.5、A512+B1.25+E5、A512+B1.25+E2.5、A256+B2.5+E5、A256+B2.5+E2.5、A256+B1.25+E5、A256+B1.25+E2.5分别免疫8组小鼠,单价甲肝灭活疫苗512EU、256EU和单价乙肝疫苗2.5μg、1.25μg以及实验性单价戊肝疫苗5μg、2.5μg免疫作为对照,采用间接ELISA法检测小鼠血清特异性抗体。探讨联合疫苗中甲肝抗原、乙肝抗原和重组HEV-p179抗原三种组分间的相互作用。 研究证实,A512组诱导小鼠产生的抗-HAV抗体水平在免疫后第4、8、20周明显高于A256组；B 1.25组抗-HBs IgG抗体水平与B2.5组全程差异无统计学意义:E2.5组和E5组小鼠戊肝抗体水平全程无明显筹异。当联合疫苗中乙肝抗原、戊肝抗原剂量相同而甲肝抗原剂量不同时,含高剂量甲肝抗原的联合疫苗组诱导小鼠产生的甲肝抗体高于含低剂量甲肝抗原的联合疫苗组；当联合疫苗中甲肝抗原、戊肝抗原剂量相同而乙肝抗原剂量不同时,联合疫苗中不同剂量乙肝抗原诱导小鼠产生的抗-HBs抗体水平在整个实验过程中无显著差异；当联合疫苗中甲肝抗原、乙肝抗原剂量相同而戊肝抗原剂量不同时,联合疫苗中不同剂量戊肝抗原诱导小鼠产生的抗-HEV抗体水平在整个实验过程中差异无明显统计学意义。经统计分析得出A512+B1.25+E2.5组和A512+B2.5+E2.5组中甲肝、乙肝、戊肝抗原比例适合。通过对联合疫苗、单价疫苗小鼠抗体亚类比较分析得出,联合疫苗和单价疫苗诱导产生的特异抗体IgG均以IgG1为主,疫苗诱导小鼠产生的免疫应答以体液免疫为主,联合疫苗中各抗原组分并没有改变小鼠免疫应答的格局。 综上所述,成功制备了实验性甲肝-乙肝-戊肝联合疫苗,观察了其免疫原性,并分析了联合疫苗中三种抗原的相互作用,探讨了疫苗诱导免疫应答的类型。通过统计分析得出当该联合疫苗中抗原组分浓度合适时联合疫苗诱导小鼠产生的抗体水平不低于同剂量的单价疫苗组。

目录

文摘

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声明

综述：乙型肝炎疫苗的研究进展

前言

第一章实验性甲型肝炎灭活疫苗的制备及其免疫原性的研究

一、前言

二材料与方法

三.结果

四、讨论

第二章交叉剂量配比的实验性甲型肝炎-乙型肝炎-戊型肝炎三联疫苗的免疫原性研究

一、前言

二.材料与方法

三.结果

四、讨论

结论

参考文献

作者简介及在学期间发表论文清单：

致谢