猪Reg3和Reg4基因的克隆与Reg4 Variant2的原核表达

摘要

Reg3、Reg4是再生基因家族(Reg)的新成员,是近年来新发现的再生基因家族(Reg)的新成员。再生基因家族(regenerating islet-derived family,REG或Reg)于1988年首次由Terazono等从大鼠再生胰岛的cDNA文库分离得到,属于钙依赖性凝集素超家族(C-type lectin super family),编码的一种分泌蛋白可以刺激胰岛p细胞的生长。目前的研究发现,Reg蛋白可能不仅对B细胞再生非常关键,而且还在哺乳动物其他生理和病理活动中起调节作用,如对肝脏、胃肠道、胰腺细胞起促增殖,抗凋亡作用,此外,与糖尿病、炎症和创伤也有关。根据Reg基因编码蛋白的一级结构,Reg家族可分为4个型:Reg1、Reg2、Reg3及Reg4,应用生物信息学软件对Reg家族成员进行蛋白序列的比较显示,4个成员在一级结构和三维结构模拟结果均相似,说明它们在进化上的保守性。
　　 为了研究Reg在猪体内是否具有同样的功能,我们克隆了猪Reg3、Reg4基因,并得到了相应的融合蛋白,试验分两个部分。
　　 一、猪Reg3、Reg4基因的克隆、序列分析与结构预测。利用同源序列克隆原理设计一对克隆引物,对猪十二指肠黏膜组织提取的总RNA进行RT-PCR,将PCR产物与pMD19-T载体连接后转化E.coli JM109感受态细胞,筛选阳性克隆、测序,并进行序列分析；结果成功克隆了猪Reg3、Reg4基因,并注册到GenBank(Accession.FJ531494,FJ469910,FJ469911),初步检测了在组织中的分布。
　　 二、猪Reg4 Variant2基因的原核表达。根据克隆序列设计一对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出EcoRI/HindⅢ酶切位点的Reg4 Variant2片段,双酶切后亚克隆至pET21b(+)载体,构建重组原核表达载体pET21b(+)～Reg4 Vatiant2,转化宿土菌E.coli BL21,经IPTG诱导进行表达,SDS-PAGE鉴定。结果成功构建了原核表达载体pET21b(+)～Reg4 Variant2,表达的融合蛋白分子量约为19.23kDa,并以包涵体形式存在。为进一步研究猪Reg4的生物学功能奠定了基础。