参附注射液联合细胞因子对人脐血和急性髓性白血病HL-60细胞来源的树突状细胞诱导生成及功能的影响

摘要

目的：研究参附注射液(SFI)联合细胞因子对人脐血单个核细胞(CBMNCs)和急性髓性白血病：M2细胞系HL-60细胞体外诱导树突状细胞(DCs)生成及功能的影响。 方法：用不同浓度的参附注射液(终浓度分别为9.38mg/ml，18.75mg/ml，37.5mg/ml、75mg/ml和150mg/ml生药浓度)、粒-巨噬细胞集落因子(GM-CSF)+白细胞介素-4(IL-4)及GM-CSF+IL-4联合不同浓度SFI三种组合在体外诱导培养CBMNCs及HL-60细胞，获得DCs。倒置显微镜和Wright染色观察DCs的形态变化；流式细胞仪检测DCs表型(CD83、CDla、HLA-DR、CD80)的表达率；MTT法检测同种混合淋巴细胞反应(allo-MLR)鉴定DCs刺激T淋巴细胞的增殖能力；ELISA法测定DCs培养上清液中INF-γ的含量。 结果 1．形态改变：处理前HL-60细胞、CBMNCs细胞呈球形，悬浮生长，表面光滑。仅加入GM-CSF及IL-4培养2天后，两组部分细胞体积增大、增殖并开始表现多形性，培养8～12天左右时可见较多具有典型树突状突起的细胞。而单独应用不同浓度SFI培养的HL-60细胞及CBMNCs细胞可见：150mg/ml、75mg/ml SFI处理孔细胞全部破碎死亡，37.5mg/ml细胞增殖缓慢，18.75mg/ml、9.38mg/ml处理孔中细胞体积增大并增殖明显，但培养至8～12天均未见具有树突状突起的细胞。GM-CSF+IL-4联合不同浓度SFI诱导培养的HL-60细胞及CBMNCs细胞呈现不同的变化：150mg/ml SFI组中细胞全部破碎死亡、75mg/ml SFI组体积稍增大，但增殖缓慢，且树突状突起的细胞少见；但在37.5mg/ml、18.75mg/ml、9.38mg/ml SFI处理孔中细胞体积增大并增殖，培养8～12天左右时典型树突状细胞比例明显增加，尤以HL-60细胞18.75mg/ml SFI组和CBMNCs37.5mg/ml SFI组DCs形态的细胞比例最高，并可见细胞集落。 2．细胞表型：培养前HL-60细胞、CBMNCs以及空白对照组的DCs表型CD83、CDla、HLA-DR、CD80表达很低。而单独以SFI诱导培养的HL-60细胞和CBMNCs上述DCs表型表达仍不高。以GM-CSF+IL-4诱导8～12天后，细胞表型表达率均高于培养前和单独以SFI培养组，差异有统计学意义(HL-60-DCs分别为8.33％±1.76％、11.86％±3.86％、7.70％±1.51％and 1.82％±0.27％。CBMNC-DCs分别 12.36％±2.79％、15.23％±2.04％、26.90％±6.17％and14.6％±4.31％)(P<0.05，HL-60-DCs的CD80，CBMNC．DCs的HLA．DR除外)。以GM—CSF+IL．4和不同浓度SFI诱导培养后，HL-60细胞以18.75mg/mlSFI+GM-CSF+IL-4 和 CBMNCs 细胞以 37.5mg/mlSFI+GM-CSF+IL-4培养的DCs标志表达最高，分别为HL-60-DCs CD83 18.75％±6.18％、CDla 24.32％±7.44％、HLA-DR 26.99％±7.42％和 CD80 18.24％+3.13％，CBMNC-DCs为27.33％±8.26％、39.28％±9.41％、49.43％±15.89％和32.07％±5.92％，并显著高于其他各组(p<0.05)，且有很好的协同作用(p<0.05)。GM-CSF+IL-4与其他浓度SFI联用DCs表型表达率虽高于单用GM-CSF+IL-4培养组，但无显著差异(p>0.05)。CBMNCs和HL-60细胞相比，HLA-DR、CD80表达率CBMNCs高于HL-60细胞，有显著差异(p<0.01)，CD83、CD1a无显著差异(p>0.05)。 3．刺激同种异体T细胞增殖的能力：HL-60细胞和CBMNCs的空白对照组以及18.75mg/ml SFI培养组仅有较弱的刺激T淋巴细胞增殖能力，且随着效靶比增加，刺激能力没有相应提高。在HL-60细胞、CBMNCs细胞中以GM-CSF+IL-4或SFI与GM-CSF+IL-4联用培养的DCs，刺激T淋巴细胞增殖的能力显著高于上述各组细胞。当效靶比为1：100，1：30，1：10时，刺激指数分别为HL-60-DCs 1.606±0.074 VS．2.280±0.097 VS．2.415±0.090和2.106±0.174 VS．2.728±0.125 VS．3.196±0.137，CBMNC-DCs为1.827±0.129 VS．2.217±0.157 VS．2.503±0.159和2.218±0.160 VS．2.632±0.079 VS.3.143±0.043(均r=0.949，P<0.01)。并且SFI与GM-CSF+IL-4联用组显著高于GM-CSF+IL-4组(p<0.05)。HL-60-DCs和CBMNC-DCs刺激T淋巴细胞增殖的能力没有显著差异(P>0.05)。 4．INF-γ的分泌水平：HL-60细胞与CBMNCs不同组合条件下培养的上清中均有不同程度INF-γ，的分泌，其中18.75mg/ml SFI组INF-γ含量低于GM-CSF+IL-4组HL-60(22.887±7.575)pg/ml VS．(37.350±8.306)pg/ml，CBMNCs(30.630±6.993)pg/ml VS．(48.020±9.280)pg/ml(p<0.01)。GM-CSF+IL-4联合SFI组中GM-CSF+IL-4联合18.75mg/mlSFI组培养的HL-60细胞和37.5mg/ml SFI组培养的CBMNCs上清中INF-γ含量显著高于GM-CSF+IL-4联合其他浓度SFI培养的细胞，分别为HL-60细胞组(73.340±14.402)pg/ml，CBMNCs组(90.410±12.189)pg/ml(p<0.01)，且有很好的协同作用(p<0.05)。其他浓度SFI组含量不同程度的高于GM-CSF+IL-4组，但无统计学意义(P>0.05)。HL-60细胞和CBMNCs两组细胞分泌INF-γ作用无显著性差异。 结论： 1．体外单用SFI不能诱导人脐血和急性髓性白血病细胞分化为DCs。 2．体外单用GM-CSF+IL-4可诱导人脐血和急性髓性白血病细胞分化为DCs，并具有DCs的特异性标志及功能，但不成熟。 3．适当浓度SFI联合GM-CSF+IL-4在体外能更有效地诱导人脐血和急性髓性白血病细胞分化为DCs，并促进DCs成熟，增强DCs功能。 4． SFI联合GM-CSF+IL-4在体外诱导培养人脐血单个核细胞分化为DCs的最佳浓度为37.5mg/ml，诱导急性髓性白血病分化为DCs的最佳浓度为18.75mg/ml，且与GM-CSF+IL-4联合使用时有很好的协同作用。 5．在一定范围内，不同浓度的SFI具有抑制或促进人脐血和急性髓性白血病细胞增殖的双向调节作用。 6．脐血诱导培养的DCs抗原提呈能力与急性髓性白血病源的DCs相似。 7．成熟DCs可分泌INF-γ，同时其抗原递呈能力也相应提高。

目录

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摘要

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 树突状细胞及在血液病治疗中研究进展

致谢

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