广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析

摘要

戊型肝炎（Hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起的消化道病毒性肝炎。大量的报道已经证实，HE在国内外均非常的盛行，人和多种动物对HEV均易感。广西为我国养猪大省，但对于猪群HE的调查及HEV的抗原性研究仍处于起步阶段，因此弄清广西猪戊型肝炎的流行状况、猪源HEV与人源HEV在基因水平上的差异、HEV抗原表位的分布及抗原性基因的特征，对于戊型肝炎的防治、疫苗的研发都具有重大的意义。
　　 研究一，本研究通过RT-nested-PCR的方法对2009年07月至2010年03月从广西6个市县13个不同规模猪场采集的135份新鲜猪粪进行检测。结果显示135样品中有38份为HEV RNA阳性，阳性率为28.1％。在调查的13个猪场中，仅有一个猪场未检测到HEV RNA，猪场阳性率为92.3％。各猪场样品检出率在0-44.4％之间，13各猪场中有8个猪场感染率处于30-45％之间。
　　 对13个猪场中各种年龄样品均能采集到的6个猪场的猪群进行感染率调查，67份不同月龄的样品中，0-30日龄HEV RNA阳性率为0％;31-60日龄阳性率为7.7％;61-90日龄HEV RNA阳性率为40％;91-120日龄HEVRNA阳性率最高，为58.8％;当猪群年龄超过120日龄后HEV RNA阳性率逐渐降低，阳性率为30.8％。结果显示2-4月龄为猪群的感染高峰期，32份样品中有16份样品为HEV RNA阳性，阳性率为50％。
　　 随机对24份阳性样品进行克隆，去除4份同源性为100％的分离株后得到20株同源性不一致的毒株。20株分离株间核苷酸同源性为91.2-99.7％。与基因型Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅱi型、Ⅳ型及禽HEV参考序列核苷酸同源性分别为：78.6-83.4％,75.9-77.9％,75.3-81.4％,83.4-97.7％,55.6-58.9％。20株分离株间氨基酸同源性为97.7-100％，其中13株氨基酸同源性为100％。与基因型Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型及禽HEV参考株氨基酸同源性分别为：92.4-95.5％,93.1-93.9％,94.7-97％,97.7-100％,55.6-56.5％。
　　 通过用MEGA4.1软件Neighbor-Joining中的P－距离法对20株分离株及各基因型参考株进行进化树构建与分析，结果显示所有的分离株均属于基因型Ⅳ型。在所有Ⅳ型序列中又可以分为6个亚型，本研究所有的分离株都分布在亚型b中。
　　 研究二，参考中国T1株序列设计巢式引物，从新鲜猪粪中扩增HEV部分基因片段，长为1725bp，位于HEV ORF2205-1929bp之间，命名为HEVORF2-A。其后根据HEVORF2-A序列设计三对引物分别扩增HEVORF2-A三段连续的基因片段，命名为HEVORF2-B1、HEVORF2-B2、HEVORF2-B3，分别位于HEVORF2-A1-576bp，577-1149bp，1150-1725bp之间。将四段扩增的基因片段分别与表达载体PET32a(+)连接，转入BL21(DE3)plysS感受态细胞，IPTG进行蛋白诱导。经1mmol/L的IPTG在37℃诱导6小时后，除PET32a-A在82.6kd处有微量融合蛋白表达外，PET32a-B1，PET32a-B2，PET32a-B3分别在41.3kd、41.5kd、41.8kd处有高水平的融合蛋白表达。用自然感染猪血清和万泰HEV ELISA诊断试剂盒阳性对照血清进行western-blot检测，三个短的融合蛋白均能检测到明显的条带，表明本研究所构建的三个表达载体具有良好的抗原性。