斜带石斑鱼腺苷酸环化酶刺激多肽Ⅰ型受体cDNA的克隆和序列分析及表达

摘要

该文采用RT-PCR方法和cDNA末端快速扩增技术(RACE),从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)下丘脑总RNA中进行扩增,得到3种形式的PAC1-R cDNA全长序列,分别是PAC1-R、PAC1-R3u和PAC1-Rct.PAC1-R是与其它物种PAC1-R同源性很高的形式,cDNA全长为2320bp,编码447个氨基酸;PAC1-R3u是只有3'非编码区与PAC1-R不同,而5'非编码区、编码区都与PAC1-R相同的形式,迄今只在大鼠中发现了5'非编码区发生变化的PACAP Ⅰ型受体,至于PACAP Ⅰ型受体的选择性剪接发生在3'非编码区的形式,还未见有报道,其cDNA全长为2257bp,编码447个氨基酸;PAC1-Rct,在核苷酸序列上与斜带石斑鱼PAC1-R有很大不同;在氨基酸层面上,C末端发生很大的变化,其cDNA全长为1853bp,由402个氨基酸组成.在斜带石斑鱼中发现的几种新的形式扩大了PACAP Ⅰ型受体家族,使之成为G蛋白偶联受体家族中变化最多的受体之一.将斜带石斑鱼三种PACAP Ⅰ型受体的氨基酸序列与其它脊椎动物进行同源性比较,并构建出进化树,结果显示:斜带石斑鱼PAC1-R、PAC1-R3u与金鱼PAC1-R的亲缘性最近,而与斜带石斑鱼PAC1-Rct的亲缘性次之,表明PAC1-Rct是一种变化较大的形式;在进化距离上,斜带石斑鱼三种PACAPⅠ型受体与两栖类的蛙亲缘性较高,与哺乳类的人和鼠类的亲缘性较低.利用生物信息学软件及数据库进行蛋白质成分分析,寻找该蛋白的保守区、等电点、分子量、不稳定指数和消光系数等生物学特征,并预测蛋白序列的motif、低复杂度区域、卷曲螺旋、跨膜螺旋、疏水性、信号肽及抗原决定簇等结构功能域,以指导对斜带石斑鱼的PACAP Ⅰ型受体基因功能的进一步研究.采用半定量RT-PCR方法对斜带石斑鱼PAC1-R基因的3种不同形式在脑部各区、不同组织、以及胚胎发育和幼体发育过程中表达的情况进行了初步的研究,并通过Southern blot实验验证了RT-PCR结果的可信性.结果表明,3种形式在各脑区的表达水平都显著高于组织,正体现了PACAP作为神经递质、神经调质和神经营养因子起作用;在胚胎发育过程中,三种PACAP Ⅰ型受体都是在神经胚期开始放量表达,其表达水平远远高于其他时期,尤其是PAC1-R,证明PACAP作为一种神经营养因子在神经系统发育中起重要作用;在幼体发育过程中,PAC1-R和PAC1-Rct的mRNA水平调节的变化情况基本与仔鱼的行为和消化系统的研究相吻合,而PAC1-R3u几乎没有表达.这些数据表明:这3种形式在不同组织以及发育过程中表现出选择性表达,即它们的表达不是细胞特异性的,而是大部分组织或不同时期拥有不同比例的每种受体形式.将编码斜带石斑鱼PAC1-R基因克隆于表达载体pET-15b构建成表达质粒gPAC1-R-pET-15b.大肠杆菌BL21在转化后gPAC1-R-pET-15b经IPTG诱导表达了微量的gPAC1-R融合蛋白.我们对表达条件如温度、IPTG浓度和诱导时间进行了优化,但收效甚微.用小鼠抗His-Tag抗体进行Westernblotting检测,结果显示为阴性,这主要是由于表达的融合PAC1-R蛋白量极低或无表达.鉴于PACAP及其受体的研究与鱼类养殖业的密切关系及斜带石斑鱼在水产养殖上的重要性,该实验对斜带石斑鱼PACAPⅠ型受体的cDNA进行克隆和生物信息学分析以及mRNA的表达调节和原核表达开展研究,期望对鱼类PACAP Ⅰ型受体的表达特征和分子生物学有进一步的了解,为使PACAP应用于鱼类养殖,促进鱼类生长和繁殖提供更深入的理论指导.

目录

文摘

英文文摘

引 言

第1章斜带石斑鱼PACAPI型受体cDNA的克隆和序列分析

1.材料

2.方法

3.结果和讨论

第2章斜带石斑鱼PACAPI型受体核苷酸序列分析和蛋白功能结构生物信息学研究

1.材料和方法

2.结果和分析

3.讨论

第3章斜带石斑鱼PACAPI型受体mRNA表达的研究

1.材料

2.方法

3.结果和分析

4.讨论

第4章斜带石斑鱼PACAPI型受体基因在大肠杆菌中表达的初步研究

1.材料

2.方法

3.结果和分析

4.讨论

参考文献

附录PACAPI型受体序列表

缩略表

致谢

原创性声明