树突状细胞/食管癌融合疫苗诱导的细胞毒性T细胞特异性抗人食管癌免疫反应研究

摘要

第一部分树突状细胞/食管癌细胞融合疫苗诱导特异性抗食管癌免疫反应的体外实验研究。 背景与目的： 树突状细胞(Dendritic cells，DCs)是人体专职的抗原呈递细胞，以DCs为基础的DC/肿瘤细胞融合疫苗可以有效地诱导特异性抗肿瘤免疫应答，本研究旨在探讨成熟的DCs与人食管癌细胞株EC109细胞融合疫苗的制备及其体外诱导特异性抗食管癌细胞的免疫反应。 材料和方法： (1)采用Ficoll-Hypaque密度梯度法，从健康志愿者外周血中分离出单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，在重组人粒/巨噬细胞集落刺激因子(Recoml)inant human granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor，rhGM-CSF)和白介素(Interleukin-4，IL-4)作用下体外诱导分化成熟的DCs。 (2)采用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)化学融合法使成熟DCs与EC109细胞按5∶1比例融合制备DC/EC109细胞融合疫苗。 (3)FITC标记的CD86单抗和PE标记的MuC1单抗对融合细胞进行双色荧光免疫染色，流式细胞率检测同时表达CD86和MUC1抗原的细胞的比率，即成功融合细胞的比率。 (4) 分别以融合细胞、肿瘤细胞及DCs作为刺激细胞，四甲基偶氮唑盐(MTT)试验检测其刺激T淋巴细胞的增殖活性，并比较三组T淋巴细胞的增殖活性。 (5) 分别以融合细胞、肿瘤细胞及DCs诱导的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Tlymphocytes，CTLs)作为效应细胞，以EC109细胞作为靶细胞，乳酸脱氢酶(LDH)试验检测三组效应细胞对靶细胞的杀伤作用并进行比较。 (6) 以融合细胞诱导的CTLs作为效应细胞，分别以EC109细胞、人胃癌细胞株SGC7901及人乳腺癌细胞株MCF7作为靶细胞，LDH试验检测效应细胞对三组靶细胞的杀伤作用并进行比较。 结果： (1) 成熟的DCs与EC109细胞的平均融合率为22.25﹪。 (2) DC/EC109细胞融合疫苗能有效地刺激T淋巴细胞增殖反应，在刺激细胞与反应细胞比例相同的情况下，DC/EC109融合细胞对T淋巴细胞增殖的刺激指数明显高于DCs或ECl09细胞对T淋巴细胞增殖的刺激指数，差异有统计学意义(P<0.05)，且融合细胞刺激T淋巴细胞增殖的能力随着刺激细胞与反应细胞比例的增加而增强。 (3) 效靶比相同时，经DC/EC109融合细胞诱导产生的CTLs对EC109细胞的杀伤率显著高于肿瘤细胞组和DCs组诱导产生的CTLs的杀伤率，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着效靶比的增加，所产生的CTLs对EC109细胞的杀伤活性也随之增强。 (4) 融合疫苗诱导的CTLs对EC109细胞的杀伤作用显著强于对SGC7901细胞及MCF7细胞的杀伤作用，差异有统计学意义(P<0.05)。 结论： (1) 采用PEG化学融合法可以在体外成功融合成熟的DCs与EC109细胞，制备DC/EC109细胞融合疫苗。 (2) DC/EC109细胞融合疫苗能有效地在体外诱导抗原特异性CTLs。 (3) DC/食管癌融合疫苗诱导的CTLs可以有效地产生抗食管癌EC109细胞的特异性免疫应答，表明融合细胞疫苗在食管癌的治疗上可能具有一定的临床应用前景。 第二部分树突状细胞/食管癌融合疫苗诱导的抗原特异性CTLs对人食管癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用及生物学影响。 背景与目的： 食管癌的发病率和死亡率在我国均居恶性肿瘤的第四位，是严重危害我国人民健康和生命的疾病，目前的综合治疗手段疗效有限，需探索能够有效治疗食管癌的其他治疗手段。肿瘤的生物免疫治疗目前被认为是继手术、放疗、化疗之后对肿瘤具有确切效果的又一治疗方法，而其中树突状细胞/肿瘤细胞融合疫苗在抗肿瘤免疫中起着极其重要的作用。本研究旨在证实DC/肿瘤细胞融合疫苗诱导的抗原特异性CTLs对食管癌细胞的体内特异性杀伤作用，探讨抗原特异性CTLs对移植瘤的生长抑制作用及对移植瘤细胞生物学特性的影响，为DC/食管癌细胞融合疫苗的临床应用提供依据。 材料和方法： (1) 常规培养食管癌EC-109细胞，收集处于对数生长期的EC-109细胞，用生理盐水配成2×10<'7>/ml瘤细胞悬液，无菌条件下用注射器抽取瘤细胞悬液0.5 ml接种于裸小鼠右侧腋部皮下使之荷瘤。 (2) 采用Ficoll-Hypaque密度梯度法，从健康志愿者外周血中分离出单个核细胞，在细胞因子rhGM-CSF和IL-4作用下体外诱导分化培养成熟的DCs，同时收集并培养T淋巴细胞。 (3) 采用PEG化学融合法使成熟DCs与EC109细胞按5∶1比例融合制备DC/EC109融合疫苗。 (4) 以DC/EC109融合细胞作为刺激细胞(Stimulators，S)，T淋巴细胞作为反应细胞(Resporlders，R)，按S∶R=100∶1混匀以诱导CTL<,s>并采用尼龙毛柱分离法纯化激活的T淋巴细胞。 (5) 将成功荷瘤的裸鼠随机分成A、B、C三组。A组(n=10)以融合细胞诱导的CTLs瘤内注射进行免疫治疗，B组(n=11)以未激活的T淋巴细胞瘤内注射进行免疫治疗，C组(n=11)以无血清RMPI-1640培养液瘤内注射作为空白对照组。每周注射1次，共4次。 (6) 每周测量各组裸鼠移植瘤的最大径及最小径，计算各组肿瘤平均体积，绘制各组肿瘤组织生长曲线，4周后用颈椎脱位法处死动物，剥离原位肿瘤，测量各组肿瘤的体积及湿重，比较各组肿瘤的平均体积和平均湿重。 (7) 取移植瘤组织经10﹪甲醛固定脱水、石蜡包埋切片、HE染色作常规病理检查，并采用免疫组化S-P法，检测全部裸鼠移植瘤PCNA的表达情况，用PCNA标记指数(PCNALabel Index，PCNA-LI)表示PCNA阳性细胞所占比例，比较各组肿瘤细胞的平均PCNA-LI。 (8) 取新鲜肿瘤组织剪碎后制成单细胞悬液，以流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期。以S期细胞百分比(S-phase fraction，SPF)表示细胞的增殖活性，比较各组肿瘤细胞的平均SPF值以及平均细胞凋亡率。 (9) 分别取移植前体外培养的处于对数期生长的食管癌细胞株EC-109细胞及C组移植瘤组织单细胞悬液，流式细胞仪检测两种细胞表面MUC1抗原的表达。 结果： (1) 共有33只裸小鼠荷瘤成功，总的成瘤率为82.5﹪，第一次免疫治疗后A组裸小鼠意外死亡1只。 (2) 从肿瘤的生长曲线可见，治疗开始后，三组肿瘤的平均体积差异逐渐明显，治疗结束时A组肿瘤的平均体积明显小于B、C两组(P<0.05)，差异有统计学意义。 (3) 治疗结束后A、B、C三组肿瘤的平均体积分别为(881.45±31.14)mm<'3>、(1493.37±51.67)mm<'3>、(2065.77±87.55)mm<'3>，A组肿瘤的平均体积明显小于B、C两组(P<0.05)，差异有统计学意义。三组肿瘤的平均湿重分别为(0.88±0.04)g、 (1.38±0.07)g、(2.04±0.11)g， A组肿瘤的平均湿重明显低于B、C两组(P<0.05)，差异有统计学意义。 (4) 移植瘤组织病理学检查见A组肿瘤中可见大量凋亡的肿瘤细胞，肿瘤组织中淋巴细胞浸润明显，而C组肿瘤则瘤细胞丰富、生长旺盛，呈浸润性生长，肿瘤组织中淋巴细胞浸润少。 (5) 免疫组织化学染色可见PCNA在各组移植瘤细胞中均有表达，A、B、C三组肿瘤的平均PCNA标记指数分别为(26.83±0.95)﹪、(51.82±1.51)﹪、(68.93±2.40)﹪。统计学分析表明，A组PCNA标记指数明显低于B、C两组(P<0.05)，差异有统计学意义。 (6) A、B、C三组肿瘤的细胞周期SPF分别为(12.46±0.36)﹪、(29.39±0.96)﹪、(42.25±1.43)﹪，比较三组肿瘤细胞周期的SPF，可见A组SPF值明显低于B、C两组(P<0.05)，差异有统计学意义。A、B、C三组肿瘤细胞的平均凋亡率为分别为(38.03±1.21)﹪、(17.75±0.56)﹪及(6.59±0.22)﹪，统计学分析表明细胞平均凋亡率明显高于B、C两组(P<0.05)，差异有统计学意义。 (7) 食管癌细胞株EC-109细胞MUC1表达率为99.3﹪，C组裸鼠移植瘤细胞表面抗原MUC1的平均表达率为97.5﹪，两者基本一致。 结论： (1) 本研究成功建立了人食管癌EC～109细胞裸鼠皮下移植瘤动物模型。 (2) 本研究证实了DC/EC-109细胞融合疫苗体外诱导的抗原特异性的CTLs瘤内注射具有抑制人食管癌皮下移植瘤生长的作用。 (3) 融合疫苗可以抑制食管癌细胞的增殖、局部诱导食管癌细胞周期阻滞及细胞凋亡。 (4) 该治疗方法抑瘤作用明显，提示融合疫苗体外诱导的CTLs瘤内注射有可能成为一种有效的抗食管癌治疗方法。

目录

文摘

英文文摘

第一部分树突状细胞/食管癌细胞融合疫苗诱导特异性抗食管癌免疫反应的体外实验研究

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 树突状细胞/食管癌融合疫苗诱导的抗原特异性CTLs对人食管癌祼鼠移植癌的生长抑制作用及生物学影响

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

结论

综述：树突状细胞/肿瘤细胞融合疫苗与肿瘤的免疫治疗

附录：英文缩略语

致谢

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