第一部分蒙，汉族TIM1基因多态性和IL13表达与PNS的相关性研究；第二部分蒙，汉族TIM3基因多态性和IFN-γ表达与PNS的相关性研究

摘要

本文分以下几部分展开论述：
　　第一部分：
　　目的:本实验目的在探讨内蒙地区蒙汉两族TIM-1基因多态性差异及其与儿童原发性肾病综合征的关系;探索IL-13与PNS之间的关联，为PNS的治疗提供新思路。
　　方法：1.样本:病例组的选择:2014-10至2015-12期间，在内蒙古医科大学附属医院儿内科和国际蒙医院住院的确诊为初发PNS的患儿21例;对照组:于内蒙古医科大学附属医院及国际蒙医院同一时期同地区的健康体检汉族儿童20例、蒙古族儿童20例作为汉族及蒙古族正常对照。2.纳入标准:病例组依照我国儿童PNS诊断标准，确诊为PNS;对照组除外变应性疾病、肾脏病史及肾脏病家族史、近期免疫抑制剂应用史。3.采集受试对象外周静脉血液标本2ml各2管，均取自于清晨空腹，按要求妥善存放，将所提取的血液标本按步骤提取DNA及检测IL-13浓度。4.实验方法:TIM-1-1454G/A位点多态性检测用到的方法包括聚合酶链反应和限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)、琼脂糖凝胶电泳和基因测序等方法。IL-13检测采用酶联免疫吸附试验完成。5.数据分析:将所得数据运用正确的统计学方法，采用统计学相关软件，得出各组的基因型以及频率等结果，将数据结果进行统计学比较，检验水准为α=0.05，当P＜0.05，差异有统计学意义，反之则为无意义。
　　结果：1、PNS患儿启动子-1454G/A基因型GG、AG、AA的频率为0.905，0.095，0.0;汉族对照组基因型GG、AA、AG频率为0.55、0.4、0.05;蒙古族对照组基因型GG、AA、AG频率为0.6，0.35，0.05。2.汉族PNS组与汉族正常组的基因频率比较差异有统计学意义(x2=5.64，P＜0.025);蒙古族与汉族对照组基因型频率相比较，差异无统计学意义(x2=0.11，P＞0.05)。3.PNS组与健康对照组基因型频率分布比较，差异有统计学意义(X2=7.09 P=0.03＜0.05)。4.PNS患儿中TIM-1-1454G等位基因频率较正常组频率明显增高(OR=6.23，95％CI=1.38-28.22，P=0.01)。5.PNS患儿急性期的IL-13含量较健康对照组相比差异有统计学意义。6.蒙古族与汉族正常对照组中IL-13的水平相比较，两者无明显差异。
　　结论：1.TIM-1-1454G/A位点的基因多态性可能与内蒙地区汉族儿童PNS的发病相关;-1454G等位基因可能是内蒙地区汉族儿童PNS发病的危险因素，或者说TIM-1--1454G等位基因与PNS的易感性相关。
　　2.虽然本实验不能说明汉族与蒙古族正常儿童的TIM-1基因多态性存在差异，但在未扩大样本及对TIM-1其它基因位点进行进一步研究的前提下，并不能认为TIM-1在蒙古族与汉族对照组间不存在基因多态性。
　　3.IL-13的水平异常与PNS的发病密切相关，IL-13参与PNS的发病。
　　4.TIM-1基因多态性和IL-13水平参与了儿童PNS的发病，两者之间具体的调控途径仍然有待进一步研究。
　　第二部分：
　　目的:TIM(T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子)是一组由TIM基因编码的T细胞表面分子。TIM蛋白家族各成员在T细胞亚群上的选择性表达使之成为区分Th1和Th2细胞亚群的重要标志，同时它们在T细胞分化、T细胞效应功能、巨噬细胞活化等方面的作用被认为参与了多种自身免疫性疾病的发生、发展，从而引起了人们的关注。TIM家族是新近研究的与临床疾病密切相关的基因家族，其中TIM-3是备受关注的重要成员，其具有多重生物学效应，同时是区分Th1/Th2细胞特异性的表面标志分子，有研究其同时表达于Th17分子表而，参与机体的各项免疫应答调节，如调节IFN-r的表达，与临床疾病的发病有密切联系。Th1和Th2是效应性T细胞，但同时也具有免疫调节作用，Th1主要介导细胞免疫和炎症反应，抗病毒和抗胞内寄生菌感染，参与移植物排斥[42，32，33];Th2主要涉及B细胞增殖，抗体产生、超敏反应和抗寄生虫免疫[41,34]。两群细胞分泌的细胞因子不同，其中关键性细胞因子是Th1分泌IFN-γ，Th2分泌IL-4.然而，Th1/Th2又显示免疫调节作用[4,35,36]。Th1产生的IFN-γ可激活胞内一种称为T-bet的亚群专一性转录因子，T-bet可促进IFNG基因转录而抑制IL4基因转录[37];相反，Th2产生的IL-4可激活Th2亚群专一性转录因子Gata-3，后者促进IL4基因而抑制IFNG基因的转录[36,38]。其结果，Th1和Th2成为一类各自以对方及相关疾病为调节对象的细胞亚群[40]。IFN-γ能诱导Mψ及APC上调MHCⅡ类分子，增强抗原处理机提呈作用。IFN-γ自身及其诱导的Mψ产生的IL-12可诱导Th1细胞功能，增强迟发型超敏反应及效应CTL产生[39]。儿童原发性肾病综合征据目前研究分析，是一种以免疫介导为主的，以部分免疫沉着为主，损害肾小球组织的疾病。很多研究提示，该疾病的发生发展存在免疫紊乱的表现，主要是以Th1/Th2平衡紊乱为主[2，15，28];在该疾病的研究中，我们考虑加强对TIM家族的有关基因进行试验对比研究。TIM-3有多重的生物学效应，以调节免疫反应为主，其与特异性受体相结合，产生特定的细胞信号，在某些特殊细胞因子的刺激作用下，出现Th1类细胞的活化或增殖受到抑制，程度较为显著。从而导致出现T细胞为主的免疫朝向现负方调节的现象。增强或抑制TIM-3与其特异性配体的结合，对有关TH1/Th2失衡相关的疾病可起到改变其导向的作用[16].在各类临床疾病中均有其独特的治疗思路研究意义。因此在临床疾病的研究过程中对TIM-3分子的深入研究，对相关疾病的治疗及临床症状的缓解会起到不可估量的作用[2,3,17]。且IFN-γ在PNS患儿体内表达降低，提示Th1细胞的失活有可能参与PNS的发病过程。TIM-3基因的转录发生在机体受抗原刺激的初始阶段，该阶段对T细胞分化及定型为TH1或TH2有至关重要的作用[18，30]。对TIM-3基因关于肾脏疾病的研究才刚刚开始，其分子调节功能的许多机制仍然需要大量研究。TIM-3可能成为Th细胞上免疫调节治疗的靶向分子。本实验目的是研究TIM-3基因多态性及IFN-γ水平与儿童原发性肾病综合征(PNS)发病机制的相关性。
　　方法:采用病例对照研究，选取居住于内蒙古自治区汉族PNS患儿21例，正常蒙古族（祖籍三代以上均为蒙古族，居住于锡盟地区的蒙古族）、汉族（祖籍三代以上均为汉族，家族中无蒙汉通婚史）对照组各为20例，采用PCR-限制性片段多态性分析、PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和毛细管电泳分析，基因测序技术检测PNS患儿和40例健康儿童（健康对照组）的TIM-3基因外显子-574A/C的SNP的多态性，计算基因型及等位基因频率的统计。采用酶联免疫吸附实验检测血IFN-γ水平，分析其与原发性肾病综合征发生发展中的作用及检测IFN-γ的临床诊断意义。
　　结果:(1)健康汉族对照组TIM-3外显子区-574位A/A，A/C，C/C基因型频率分别为:30％，45％，25％，蒙古族该位点的出现频率为:20％，55％，25％;蒙古族与汉族的正常对照组比较差异无统计学的意义(x2=0.6，P＞0.05，)而PNS组频率分别为9.5％，28.6％，61.9％;该数据统计的基因型频率与汉族健康对照组比较出现的差异统计学有意义。（x2=7.08，P=0.05）;将总体正常对照组与病例组比较差异具有显著性，有统计学意义（x2=7.16，P=0.05）;PNS患儿携带-574C/C等位基因的频率增高(OR=4.875，ORL=1.58，ORu=14.1;P=0.05);(2)由于TIM-3对IFN-γ的转录翻译有一定的调控作用[12]，我们在进一步对其细胞因子水平进行研究。21例PNS患儿及40例正常对照组血清IFN-γ的水平进行检测，分析其与PNS临床指标的关系。PNS组与正常对照组相比，血清IFN-γ的水平无明显差异性。各组间差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　结论:TIM-3基因外显子-574A/C的单核苷酸多态性可能与儿童肾病综合征的发病机制相关。但在细胞因子水平，IFN-γ无明显的差异性变化。

目录

摘要

前言

第一部分

1．研究背景和目的

2．对象和方法

3．结果

4．讨论

5．小结

参考文献

第二部分

1．研究背景

2．材料和方法

3．结果

4．讨论

5．结论

参考文献

综述

TIM-1基因多态性与原发性肾病综合征的研究进展

临床疾病研究中关于TIM-3分子的相关进展

中英文缩写词对照表

致谢

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