钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32的克隆、表达及其在钩端螺旋体抗体检测中的应用

摘要

钩端螺旋体病(简称钩体病)是由致病性钩端螺旋体(简称钩体)引起的一种人兽共患的自然疫源性疾病。钩体血清型别众多，临床表现多种多样。目前钩体病血清学的主要检测方法是国家标准即显微镜凝集试验(MAT)，需要培养各种血清型的钩体活菌，操作繁琐，安全性差且需要暗视野显微镜，无法在基层开展该项目的检测工作。钩体外膜脂蛋白LipL32是各种致病性钩体中高度保守的抗原成份，可刺激机体产生中和抗体。因此该抗原有可能应用于抗体检测。 本课题用PCR法扩增致病性钩端螺旋体黄疸出血群(56601株)LipL32蛋白的全长基因片段，与表达载体pET-30a(+)连接并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白，Western blot鉴定免疫活性后用电洗脱法进行纯化。纯化后的LipL32重组蛋白用间接ELISA和夹心ELISA法对不同的人和动物血清进行检测，以MAT为参照标准进行比较。 主要结果如下： 1.纯化的重组蛋白用间接ELIsA和夹心ELISA法对致病性钩体15株标准菌株的兔免疫血清全部检出，对7株腐生性钩体菌株的兔免疫血清全部未检出，与MAT检测结果相符。表明该重组蛋白能区别腐生性和致病性钩体感染。进一步确证黄疸出血群(5660l株)外膜脂蛋白LipL32基因在致病性钩体中高度保守。 2.重组蛋白检测确诊钩体病人的9例急性期和恢复期双份血清标本，急性期9份血清，MAT有2份出现阳性，间接ELISA和夹心ELISA法分别可检出3份和2份阳性，进口ELISA检测试剂盒则是2份阳性，4份可疑。对于恢复期9份血清，MAT检出9份阳性，间接ELISA和夹心ELISA法均检出8份阳性，进口ELISA则是1份阳性，7份可疑。提示该重组蛋白包被的间接ELISA和夹心ELISA在钩体病检测方面与MAT相似，恢复期优于进口试剂盒。 3.重组蛋白检测不同血清标本，45份MAT阳性标本，间接ELIsA法敏感性为71.11％(32/45)，夹心ELISA敏感性为80.00％(36/45)，而进口ELISA试剂盒检测则是阳性13份，占28.89％(13/45)，25份可疑占55.56％(25/45)。在特异性检测方面，检测MAT阴性血清59份(其中健康体检血清43份，非钩体发热病人16份，包括恙虫病阳性和出血热阳性各8份)间接ELISA和夹心ELISA法特异度均为96.61％(57/59)，进口ELISA检测健康体检血清14份，均为阴性，检测非钩体发热病人16份，则出现1份阳性，12份可疑。对梅毒螺旋体质控阳性血清10份，四种方法均为阴性。证明该重组抗原在敏感性方面略高于进口试剂盒，特异性与MAT相同，大大好于进口试剂盒，在钩体流行病学大样本人群调查中可用于初筛。 4.重组蛋白应用于夹心ELISA法检测鼠血清标本，以MAT为标准。检测274份标本，夹心ELISA的敏感性为86.75％(131/151)，特异性为99.19％(122/123)，符合率为92.34％(253/274)。结果表明夹心ELISA对鼠血清钩体抗体的检测显示较好的敏感性和特异性。夹心ELISA操作简单，特别适用于大样本钩体病现场血清流行病学宿主动物的调查。

目录

论文说明：主要英文缩写词表

声明

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 钩端螺旋体病防治的研究进展

研究生期间发表论文

致谢