高GC含量人类基因组DNA片版扩增方法的研究

摘要

PCR技术自1985年建立以来，发展到今天已经有20多年的时间了，技术不断的发展进步，使它已经成为分子生物学研究中不可缺的一项实验技术。但是在实际应用中也表现出了它所具有的不足，尤其是针对高GC含量序列的扩增就显的力不从心。针对此方面的研究有很多，诸如增加变性及退火温度，调节Mg2+浓度等方法进行扩增，也有人在PCR反应体系中加入各种促进剂，如砜类(DMSO)、甘油等，以增加PCR的特异性和产量，但上述措施对某些GC含量高的DNA模板的PCR扩增无效。因此，本文针对高GC含量的人类基因组DNA片段进行扩增，对高GC扩增方法做进一步的研究。
　　 本文构建了人类各条染色体上基因内高GC片段的数据库，并建立了98段人类基因组内长度为700～800bp高GC片段的实验模型，在此基础上分别研究了人类全基因组基因内高GC片段GC含量、长度、位置的分布规律，及有机试剂、甜菜碱、限制性内切酶、纳米材料等对高GC片段扩增结果的影响。
　　 本文通过对人类全基因组基因内高GC片段生物信息的归纳和总结，发现这些片段主要在1、16号染色体上集中最多，而在18号染色体上分布最少。
　　 本文利用限制性内切酶切割基因组DNA以此来优化PCR的效率，实验表明此方法对GC含量为61％和76.7％的序列能扩出目的序列但同时有非特异性产物的出现，但对于这批模板中大多数难扩增高GC片段来说，此方法扩增效果微弱。
　　 本文用国际报道对高GC扩增有显著作用的甜菜碱扩增所有片段，结果表明它对高GC片段扩增有一定促进作用，但不能解决本实验模型中所有的高GC片段；PCR体系中添加有机试剂，实验结果表明1，2-丙二醇、乙二醇对高GC片段扩增有显著促进作用，且二者的扩增效果和扩增范围都优于甜菜碱；对于极难扩增的引物，运用1，2-丙二醇、乙二醇、甜菜碱的混合作用能起一定的促进作用。
　　 本文运用纳米材料Ag-Pt、阴离子MPEG-△-PDA、Cs10万、Cs50万、钉、钽分别与甜菜碱、1，2-丙二醇、乙二醇混合作用于高GC片段，发现此条件能提高特异性产物的产量，并且能减少非特异条带的出现。