珠蛋白提取、ACE抑制肽的酶法制备及酶动力学的研究

摘要

我国人民的肉食主要以猪肉为主，然而，大多数肉类屠宰场中猪血利用率极低，猪血球基本上被废弃。血红蛋白是猪血中的重要成分，含铁量极其丰富。由血红蛋白提取的珠蛋白是一种非常优良的蛋白质。由蛋白酶水解珠蛋白而获得的多肽对血管紧张素工转换酶(ACE)具有很高的抑制作用。 本文通过对对珠蛋白提取的试验。确定了抗凝剂的选取为0.3％的柠檬酸三钠；确定4倍丙酮和2％NaAc添加量为珠蛋白与血红素提取的最优参数；此时珠蛋白收率为29.03g(每升新鲜猪血得珠蛋白的克数)。 利用胃蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的单酶和双酶水解珠蛋白，进行珠蛋白的酶解试验，反应时间、加酶量、底物浓度、温度和pH值等因素均对酶解液水解度产生影响。四种蛋白酶单酶及双酶水解多肽对水解度和ACE的抑制活性有不同程度的影响，通过TCA法和RP-HLPC法对水解液进行水解度和ACE抑制活性测定，单酶水解中以胃蛋白酶水解液的ACE抑制率最大，为94.63％；碱性蛋白酶水解液的ACE抑制率最高为94.49％，水解度为14.42％。双酶水解试验中，胃蛋白酶与碱性蛋白酶组合的水解物的ACE抑制活性最高，达94.82％，且时间较单酶水解短，水解效率提高。在酶促反应动力学(kinetics of enzyme-catalyzed reactions)实验中利用 Lineweaver-Burk方法，分别以动物蛋白——珠蛋白为底物，求出Km和Vmax，以期找出酶的最优反应条件。 pH 2.5时，胃蛋白酶的Vmax值达到最大值，为0.190mg/ml·min，Km值较低小，此时酶分子对底物的亲和力较大；碱性蛋白酶在50℃时Km值达到最小值为13.00 mg/ml，Vmax为0.142 mg/ml·min；木瓜蛋白酶的动力学试验的结果均较胃蛋白酶和碱性蛋白酶的效果差。胃蛋白酶和碱性蛋白酶的组合酶解珠蛋白效果较佳，Vmax，Km分别为0.237mg/ml·min和6.916 mg/ml。

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致谢

第一章绪论

1.1猪血的成分与功能

1.1.1血浆

1.1.2血球

1.2 ACE的功能及其抑制剂的研究意义

1.3 ACE抑制剂的研究进展及作用机理

1.3.1化学合成类

1.3.2生物降解类

1.3.3基因工程法

1.3.4 ACE抑制肽的吸收性及其机理

1.3.5ACE抑制肽的抑制机理

1.3.6 ACE抑制肽的制取方法与食物来源

1.4酶促反应动力学

1.5本文研究的主要内容与意义

1.5.1本文研究的主要内容

1.5.2本文研究的意义

第二章从猪血中提取珠蛋白和血红素工艺的研究

2.1材料与方法

2.1.1原料

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.1.4试验方法

2.2结果与讨论

2.2.1凯氏定氮法测定血红蛋白溶液含氮量

2.2.2不同抗凝剂抗凝效果的比较

2.2.3丙酮添加量对卟啉铁提取率影响

2.2.4丙酮添加量对珠蛋白颜色的影响

2.2.5 NaAc添加量对卟啉铁提取率的影响

2.3本章小节

第三章多酶水解珠蛋白多肽对ACE的抑制作用

3.1材料与方法

3.1.1试验材料

3.1.2主要仪器

3.1.3试验方法

3.2结果与分析

3.2.1蛋白质标准曲线的绘制

3.2.2不同pH值对珠蛋白水解度的影响

3.2.3反相高效液相法测定ACE抑制率

3.2.4猪血分离珠蛋白酶解实验结果与分析

3.3本章小节

第四章多酶对珠蛋白的酶解酶动力学研究

4.1主要材料与仪器

4.1.1试验材料及试剂

4.1.2试验主要仪器

4.2动力学试验设计

4.2.1酶液配置与珠蛋白水解

4.2.2酶解考察条件的确定

4.2.3利用作图法测定Km和Vmax值

4.3结果和分析

4.3.1蛋白酶的最大反应速度及米氏常数

4.3.2pH对蛋白酶酶解珠蛋白的动力学常数的影响

4.3.3温度对蛋白酶酶解珠蛋白的动力学常数的影响

4.3.4双酶与单酶酶解珠蛋白的动力学常数Vmax和Km的比较

4.4本章小节

第五章结论与展望

5.1结论

5.2展望

5.2.1优化酶解液中多肽的提取及纯化工艺

5.2.2建立酶促反应动力学模型，为合理确定酶解反应实验的各种参数提供了理论依据

参考文献