人EGF-IL-18融合基因的构建、表达及体内外生物活性的研究

摘要

目的 将人白介素．18(IL-18)基因与表皮生长因子(EGF)干扰序列编码序列连接起来形成EGF-IL．18融合基因，并将此融合基因在BL21(DE3)大肠杆菌中进行表达，然后通过体内、外实验评价表达产物的生物学活性。 方法 以pFUS-EGF-ILl8DNA为模板，应用高保真PCR扩增EGF-IL-18基因。PCR产物在经过加A反应和纯化后与pMDl8-T载体进行连接反应。连接反应产物转化DH-5t~大肠杆菌，阳性克隆的筛选和鉴定按照标准方法进行。重组pMDl8T-EGF-IL．18质粒DNA经过BamHI／Bpull02I消化后回收目的基因。pETl2a载体在经过BamHI／Bpull02I双酶切后与目的基因连接构建表达载体pETl2a(+)-EGF-IL一18，后者转化BL21(DE3)大肠杆菌。阳性克隆在LB培养基中扩大培养，IPTG25℃作用20小时诱导EGF-IL．18融合蛋白表达。利用SDS-PAGE和WesternBlot对表达产物进行分析和鉴定。 皮下注射2×106人肝癌细胞株SMMC-7721细胞至Balb／c裸鼠右侧腰部。成瘤后，将裸鼠进行随机化分成三组：EGF-IL-18组、rhlL．18组和生理盐水(NS)空白对照组，并作好鲜明标记。待肿瘤直径约为0．5～0．7cm时，瘤周注射1×106已经8Gy放射线处理的NK-92细胞后，各组裸鼠再用相应的药物瘤周注射进行治疗，每5天注射NK细胞和药物一次，共持续5次。在治疗开始之前及在各次注射治疗的时间点均量取各移植肿瘤的长短径，计算肿瘤体积。同时观察并记录裸鼠摄食、饮水等其他生长情况。在最后一次治疗的次日，通过拉颈处死全部裸鼠，切除肿瘤组织。一部分肿瘤组织制成单细胞悬液应用流式细胞术进行细胞周期和凋亡的监测。另一部分肿瘤组织，连同裸鼠的肝、肺、脾等器官一并通过10％福尔马林的固定用于常规病理切片染色和观察。 从健康志愿者抽取静脉血，密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMNCs)。利用CCK-8试剂盒测试EGF-IL．18对PBMNCs的促增殖作用。应用ELISA法检测EGF-IL．18诱导KG-1细胞分泌IFN-?。应用多参数流式细胞术检测EGF-IL．18对SMMC-7721肿瘤抗原和K562细胞抗原致敏的PBMNCs淋巴细胞亚群分布及CD4+和CDS+T细胞活化的影响。 应用SPSS13．0统计软件包、Prism4．0统计软件进行数据分析，CurveExpert13免费软件用于标准曲线的制作。 结果 在本课题中，我们应用pETl2a表达载体将EGF-IL-18融合基因在BL21(DE3)大肠杆菌中进行了高效表达，表达产物经SDS-PAGE和WesternBlot分析鉴定与我们的设计相符。经计算机模拟分析，EGF-IL．18融合蛋白与IL一18自然成熟胎在分子疏水性、二级结构等理化特性方面相似。 瘤周注射EGF-IL．18合并NK细胞注射能显著抑制SMMC-7721移植瘤的生长。在治疗结束时，SMMC-7721异种移植瘤的体积在EGF-IL．18组、rhIL-18组和空白对照组分别为0．063±0．030cm3,0．212±0．037cm3,和0．432±O．030cm3，空白对照组与EGF-IL．18组和rhlL-18组的差别是比较明显的(P<0．01)。此外，rhlL-18组与EGF-IL．18组的差别也具有统计学意义(P=0．05)。细胞周期分析表明，EGF-IL．18组有96．11±1．51％的细胞停滞在G1期，而在rhlL．18组和空白对照组则分别是813±2．02％和72．18±O．46％，前者与后两者相比均有明显的差异(EGF-IL．18vsrhlL-18：P<0．05；EGF-IL．18vscontrol：P<0．01)。同时，rhlL．18组与空白对照组相比也有明显差异(P<0．05)。EGF-IL一18组、rhlL一18组和空白对照组S期细胞的比例分别为3．69±041％，16．51±1．25％，和23．85±1．36％，前者与后两者相比均有明显的差异(EGF-IL．18vsrhlL．18：P<0．01；EGF-IL一18vscontrol：P<0．01)。同时，rhlL．18组与空白对照组相比也有明显差异(P<0．05)。肿瘤细胞自主凋亡发生率在三组中也有明显不同，与空白对照组(7．10±1．13％)相比，EGF-IL-18组(28．05±3．89％，P<0．05)、rhlL-18组(25．48±5．46％，P<0.05)肿瘤细胞自主凋亡比例明显增高，而EGF-IL-18组和rhlL-18组间无明显差异。肿瘤标本切片观察未发现各治疗组病理特征有明显差异，在各主要脏器中均未发现肿瘤转移。此外，各治疗组裸鼠再体重、摄食及饮水等方面也无明显改变。 在体外实验中，PBMNCs在EGF-IL．18组、rhlL．18组和空白对照组中的增殖活性(OD450)分别为1．14±0．07，1．02±0．42和0．84±0．01，前两者与空白对照组相比均有明显差异(EGF-IL．18vscontrol：P

目录

前言

材料与方法

结果

分析与讨论

参考文献

附录

致谢

综述基于EGFR的实体肿瘤免疫治疗

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