重金属铅酶联免疫检测方法的研究

摘要

本论文对重金属铅的酶联免疫检测方法进行了系统的研究。采用双功能螯合剂ITCBE将重金属铅离子与钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)连接制得免疫原免疫兔子，免疫亲和柱纯化血清得到高效价和高特异性的重金属铅多克隆抗体。采用双功能螯合剂ITCBE将重金属铅离子与牛血清蛋白(BSA)连接制得包被原，建立了一种间接竞争酶联免疫检测方法，对影响实验的各种因素（包被量、离子强度、pH值等）进行了优化与研究，包被量0.1μg/well，离子强度为1mmol/L的PBS，pH为7.5时所获得的标准曲线灵敏度最高，稳定性最好。本实验所建立方法的灵敏度(IC50)为3.48μg/L，检测限(IC15)为0.32μg/L。与其他金属离子的交叉反应率较低。
　　对自来水、海河水、中药白芷、胡萝卜、虾蛄中的重金属残留进行了检测。自来水直接与螯合剂ITCBE螯合后PBS稀释5倍，海河水过0.22μm的水膜后再与螯合剂ITCBE螯合，PBS稀释8倍，中药白芷、胡萝卜、虾蛄则都将其烘干粉碎后采用强酸(浓硝酸10mL，高氯酸2mL)浸泡并用高压消解罐(160℃-180℃)硝化至溶液澄清，用Tris-HCl调节pH至中性，过0.22μm的水膜，用双蒸水稀释60倍，即可用于待测分析。添加3个不同浓度的重金属铅离子，回收率可达到78.5-121％。本实验所建立的方法在自来水中的检出限为1.6μg/L，在海河水中的检出限为2.56μg/L，在其他样品中的检测限为19.2μg/kg。板内变异和板间变异均小于16％。以上结果证明所建立的方法具有很高的准确性和精密度，能满足实际样品检测的要求。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 重金属污染

1．1．1 土壤中重金属的污染

1．1．2 水体中重金属的污染

1．1．3 农作物的重金属污染

1．1．4 重金属污染的危害

1．2 重金属铅

1．2．1 重金属铅简介

1．2．2 重金属铅的危害

1．3 重金属铅的主要检测方法

1．3．1 原子荧光光度(AFS)法

1．3．2 电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法

1．3．3 电感耦合等离子原子发生光谱(ICP-AES)法

1．3．4 高效液相色谱(HPLC)法

1．3．5 酶抑制法

1．3．6 免疫分析法

1．3．7 生物传感器法

1．3．8 重金属铅的快速检测方法

1．4 论文研究的目的与意义

1．5 论文研究的主要内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 药品

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器及设备

2．1．4 样品

2．1．5 常用溶液的配制

2．2 实验方法

2．2．1 重金属铅完全抗原的制备

2．2．2 重金属铅包被抗原的制备

2．2．2 重金属铝多克隆抗体的制备

2．2．3 间接竞争酶联免疫检测方法(Indirect competition ELISA，ic-ELISA)的建立

2．2．4 样品基质影响考察

2．2．5 重金属Pb的ic-ELISA检测方法性能指标的评价

2．2．6 仪器分析法验证

3 结果与讨论

3．1 重金属铅免疫原的结构鉴定

3．1．1 免疫原Pb-ITCBE-KLH的结构鉴定

3．1．2 免疫原Pb-p-NH2-Bn-DTPA-KLH的结构鉴定

3．1．3 免疫原Pb-p-NH2-Bn-DTPA-BSA的结构鉴定

3．1．4 免疫原Pb-EDTA-BSA的结构鉴定

3．1．5 免疫原Pb-DTAP-BSA的结构鉴定

3．2 重金属铅抗体的制备

3．2．1 血清效价与亲和力的测定

3．2．2 抗体的纯化

3．2．3 纯化后抗体的效价与亲和性的测定

3．3 间接竞争酶联免疫检测法的建立

3．3．1 包被量和抗体浓度的优化

3．3．2 缓冲溶液PBS的pH值对抑制率曲线的影晌

3．3．3 封闭液种类及浓度对ic-ELISA实验的影响

3．3．4 ic-ELISA检测方法标准曲线的绘制

3．4 重金属铅多克隆抗体特异性的测定

3．5 样品基质对ic-ELISA实验的影响及消除

3．5．1 自来水的基质影响及消除

3．5．2 海河水的基质影响及消除

3．5．3 农产品的基质影响及消除

3．6 重金属铅间接竞争ELISA方法的性能指标评价

3．6．1 样品的检出限

3．6．2 检测限与灵敏度

3．6．3 准确度

3．6．4 精密度

3．6．5 ic-ELISA检测方法的稳定性实验

3．7 仪器分析法验证

3．7．1 ICP-MS检测重金属铅

3．7．2 ICP-MS样品前处理方法

3．7．3 ICP-MS验证

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士期间发表论文情况

致谢