人类Ermap-siRNA对Ara-C诱导K562细胞向红细胞系分化过程的影响

摘要

研究背景: 2000年，Ye等从鼠胚胎红细胞eDNA文库中筛选出小鼠红细胞膜相关蛋白基因(Ermap)，2001年，Su等又从人胎肝cDNA文库中筛选出人类Ermap基因，与此同时，Xu等也从妊娠第10周及22周胎肝消减cDNA文库中筛选出人类Ermap基因。 Northern Blot显示，人类Ermap基因高度特异表达于胎肝及成人骨髓等造血组织，以及K562和HEL细胞系；荧光蛋白转染试验证实其定位于293T细胞膜和其他胞浆小体上；荧光原位杂交显示其可表达于第12周和23周的胎肝红细胞、成人骨髓，以及第8～12周脐带血中的网织红细胞和原始红细胞膜。 通过对人类Ermap基因所编码的蛋白分子的分析显示，人类Ermap基因编码由475个氨基酸组成的跨膜蛋白分子，其胞外部分含一个IgV区域，该IgV区域含有一段与髓磷脂/少突胶质细胞糖蛋白 (myelin/oligodendrocyte glycoprotein，MOG)的同源序列，其内有一免疫球蛋白重链Clq识别区。ERMAP蛋白的胞内部分含一B30.2区域，该区域与泌乳糖蛋白和TRIM家族具有高度同源性。此外，ERMAP的细胞内部分还包含一些重要的结构域，如磷酸化结构域、SH3结合区结构域、双亮氨酸结构域等，因此推测ERMAP可能参与红细胞的信号转导。 2004年以来，我们在国际上首先建立了人类Ermap基因荧光定量PCR(fluorescem quantitative PCR，FQ-PCR)检测方法，在此基础上，逐步证实：①在阿糖胞苷(Ara-C)诱导K562细胞向红细胞系分化过程中，人类Ermap基因的表达量不断增加；②在脐带血单个核细胞(MNCs)向红细胞系分化发育过程中，人类Ermap基因的表达量不断增加；③人类Ermap基因在9～36周胎儿肝脏中表达，其表达量从第12周开始升高，18～20周达高峰，21周后开始下降并稳定于较低水平；④人类Ermap基因在15周胎儿骨髓中开始表达，27～32周达高峰，之后迅速下降。综上所述：人类 Ermap 基因特异表达于造血组织，编码红细胞跨膜蛋白，属免疫球蛋白超家族成员。其功能可能与红细胞系分化发育有关，在胚胎发育过程中，可能还参与了红系细胞向肝脏和骨髓的迁移活动。然而，目前对于人类Ermap基因的研究，仍然主要集中在其表达谱方面，对于其功能的研究尚待深入。 RNA干扰 (RNA interference，RNAi) 是通过小干扰 RNA (small interferenceRNA，siRNA) 介导的转录后基因沉默机制，可以有效并特异地抑制靶基因的表达。目前RNAi技术已被广泛应用于探索基因功能、基因治疗和信号转导通路等研究。 研究目的: 1．设计、合成并筛选有效的Ermap-siRNA序列。 2．制备Ermap-dsRNA质粒，建立稳定表达Ermap-shRNA的K562细胞系。 3．观察Ermap-siRNA对Ara-C诱导K562细胞向红细胞系分化过程的影响，从另一角度探讨人类Ermap基因在红细胞分化发育过程中的作用。 研究方法: 1．Ermap-siRNA的设计、合成和筛选根据人类Ermap基因序列设计并合成候选Ermap-siRNA，采用瞬时转染法，分别将候选Ermap-siRNA转染到K562细胞，采用FQ-PCR检测K562细胞人类Ermap基因表达量，并计算抑制效率，筛选出有效的Ermap-siRNA序列。 2．建立稳定表达Ermap-shRNA的K562细胞系根据第一步筛选的Ermap-siRNA，设计Ermap-dsDNA，制备Ermap-shRNA表达质粒，采用稳定转染法将其转染到K562细胞，建立稳定表达Ermap-shRNA的K562细胞系，即Ermap-shRNA/K562细胞系。 3．Ermap-siRNA对Ara-C诱导K562细胞向红细胞系分化过程的影响采用RNAi技术抑制K562细胞的Ermap表达，观察Am-C诱导Ermap-shRNA/K562细胞向红细胞系分化过程中，细胞形态、联苯胺染色细胞阳性率和细胞表面标记等的变化，同时，以FQ-PCR检测K562细胞人类Ermap基因表达量的变化。 研究结果: 1．筛选出两对有效的Ermap-siRNA 从三对候选Ermap-siRNA中，筛选出两对有效的Ermap-siRNA，即Ermap-siRNA1和Ermap-siRNA3，其序列如下： Ermap-siRNA1 Sense：GGUGAACUCUUCUUUACUAttAntisense：UAGUAAAGAAGAGUUCACCttErmap-siRNA3 Sense：GGGUCUUACCGAUGUCUGAttAntisense：UCAGACAUCGGUAAGACCCtt。 2．建立稳定表达Ermap-shRNAl的K562细胞系根据Ermap-siRNA1序列设计Ermap-dsDNA1，制备Ermap-shRNA1表达质粒，并建立稳定表达Ermap-shRNA1的K562细胞系，即Ermap-shRNA1/K562细胞。经培养0h、24h、48h和72h，其对K562细胞Ermap基因的抑制效率维持在82.36％～83.50％之间，初步证实该细胞可稳定表达Ermap-shRNA1。 3．Ara-C可诱导K562向红细胞系方向分化发育在Ara-C诱导K562细胞过程中，细胞逐渐出现红系特征，表现为：①细胞形态的改变：细胞的胞体增大，分裂相增多，浆核比值增加，核仁消失，胞浆着色逐渐变为蓝紫色或浅红色，可见较多中幼红细胞；②细胞联苯胺染色阳性率逐渐增加：Ara-C处理K562细胞0h、24h、48h和72h，联苯胺染色阳性细胞的比例分别为2.96％、17.58％、32.90％和50.16％，说明成熟红细胞比例逐渐增加；③CD235a<'+>/CD36<'->、CD235a<'+>/CD36<'+>和CD235a<'->/CD36<'+>细胞的比例逐渐增加：Ara-C处理K562细胞后72h，CD235a<'+>/CD36<'->细胞比例由处理前的15.84％增加至53.28％；CD235a<'+>/CD36<'+>细胞的比例由处理前的4.77％增加至14.29％；CD235a<'->/CD36<'+>细胞的比例由处理前的2.78％增加至12.30％。与此同时，K562细胞Ermap基因的表达量由诱导前的13.22×10<'-3>增加到诱导后72h的513.33×10<'-3>，呈现逐渐升高的趋势。 4．Ermap-siRNA1可抑制Ara-C诱导K562细胞向红细胞系分化发育的过程在Ara-C诱导Ermap-shRNA1/K562细胞过程中，细胞出现以下变化： ①细胞形态：诱导后24h，细胞形态无明显变化，诱导后48h及72h，细胞体积逐渐增大，胞浆量逐渐增多； ②细胞联苯胺染色阳性率：Ara-C诱导后0h、24h、48h，细胞联苯胺染色阳性率无明显变化(p>0.05)，诱导后72h，细胞联苯胺染色阳性率由诱导前的1.17％增加至2.04％(p<0.05)，但仍低于Ara-C诱导K562细胞组(p<0.05)； ③CD235a<'+>/CD36<'->、CD235a<'+>/CD36<'+>和CD235a<'->/CD36<'+>细胞比例：CD235a<'+>/CD36<'->细胞比例诱导前为8.83％，诱导后72h为11.28％；CD235a<'+>/CD36<'+>细胞比例诱导前为1.23％，诱导后72h为2.64％；CD235a<'->/CD36<'+>细胞比例诱导前为0.59％，诱导后为1.47％，均明显低于Ara-C诱导K562细胞组。与此同时，Ermap-shRNA1/K562细胞Ermap基因的表达量由诱导前的2.52×10<'-3>缓慢增加到诱导后72h的4.53×10<'-3>，明显低于K562细胞组。 结论: 1．针对人类Ermap基因设计并化学合成三对Ermap-siRNA，从中筛选出两对有效的Ermap-siRNA，即Ermap-siRNA1和Ermap-siRNA3，其序列分别为： Ermap-siRNA1 Sense：GGUGAACUCUUCUUUACUAttAntisense：UAGUAAAGAAGAGUUCACCttErmap-siRNA3 Sense：GGGUCUUACCGAUGUCUGAttAntisense：UCAGACAUCGGUAAGACCCtt。 2．根据Ermap-siRNA1序列设计Ermap-dsDNA，制备Ermap-shRNA1表达质粒，并稳定转染到K562细胞，建立Ermap-shRNA1/K562细胞系，初步证实该细胞系可稳定表达Ermap-shRNA1。 3．通过RNAi技术抑制K562细胞的Ermap基因，可抑制Ara-C诱导K562细胞向红系分化的过程，进一步提示人类Ermap基因与红细胞分化发育过程关系密切。 但人类Ermap基因对红细胞发育过程中的作用机理、作用环节、影响因素及其与其他造血生长因子、细胞因子、黏附分子之间的关系如何?等等，仍待进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

前言

第一部分人类Ermap-siRNA的设计、合成和筛选

引言

实验材料和仪器

实验方法

实验结果

讨论

第二部分人类Ermap-siRNAl对Ara-C诱导K562细胞向红细胞系分化过程的影响

引言

实验材料和仪器

实验方法

实验结果

讨论

全文结论

参考文献

附录一 主要溶液的配制

附录二 综述：微小RNA s与造成血调控及血液系统肿瘤的关系

附录三 在学期间发表的主要论文

致谢

原创性声明及知识产权声明