特异性抑制Tim-1表达的siRNA表达质粒的构建和Tim家族分子在小鼠肝炎模型中表达的初步研究

摘要

目的：首先构建带HA标签的Tim-1真核表达载体和针对Tim-1的具有良好抑制作用的siRNA表达载体。其次通过real-time PCR的方法初步研究Tim家族分子在ConA诱导的小鼠急性肝炎模型和HBV全基因转基因鼠中的表达水平。该实验不仅为进一步研究Tim家族分子在免疫系统中的作用提供新的实验工具，而且为下一步研究Tim家族分子在肝脏炎症疾病中的作用机制奠定基础。方法： 1.Tim-1HA融合蛋白在肝癌细胞系HepG2中的表达 以小鼠脾细胞eDNA为模板，设计引物，PCR扩增Tim-1HA融合蛋白基因片段，T-A克隆入真核表达载体pTARGE-T，构建重组表达载体pTARGETim-1HA。重组子经酶切、PCR及测序鉴定。将重组子以脂质体法转染肝癌细胞系HepG2，RT-PCR和Western blot的方法检测Tim-1HA融合蛋白表达。 2.针对Tim-1的siRNA表达载体的构建及其对Tim-IHA的抑制效果 参考siRNA的设计策略，通过基因Blast，设计并合成4对针对Tim-i cDNA序列的寡核苷酸，退火后克隆入含有U6启动子的pAVU6+27载体，构建针对Tim-1的siRNA表达载体，重组子经酶切及测序鉴定。将真核表达载体pTARGETim-1HA与4个siRNA表达载体分别共转染肝癌细胞系HepG2细胞。转染72小时后，利用RT-PCR和Western blot的方法检测siRNA对Tim-l的抑制效果。 3．制备ConA诱导的小鼠急性肝炎模型 小鼠尾静脉注射ConA 25mg/Kg体重制备急性肝炎模型，以尾静脉注射生理盐水小鼠为对照鼠，6～8小时后处死小鼠，测定小鼠血清ALT水平，取部分肝组织切片进行HE染色。 4.实时定量PCR测定Tim分子在模型中的表达根据SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)试剂盒说明测定不同模型小鼠肝组织中Tim-1、Tim-2和Tim-3 mRNA水平的表达，并进行熔解曲线分析，利用最低循环数值(Ct)比较法检测Tim家族基因的表达。 结果： 1．真核表达载体pTARGETim-IHA的构建及其在肝癌细胞系HepG2中的表达 抽提小鼠脾细胞mRNA，利用RT-PCR的方法获得长度为967bp的Tim-IHA基因片段，T-A克隆入pTARGET，构建重组真核表达载体pTARGETim-IHA，经DNA限制性内切酶图谱分析和PCR检测初步提示重组子中Tim-IHA以全长并且正向插入pTARGET载体。测序结果表明成功构建了可表达Tim-lHh融合蛋白的真核表达载体pTARGETim-IHA。重组子DNA转染HepG2细胞后，RT-PCR和Western b10t分别检测到Tim-1HA在mRNA和蛋白质水平上有表达。 2．针对Tim-I siRNA表达载体的构建及其对Tim-IHA的抑制效果 设计并合成针对Tim-1 cDNA序列的寡核苷酸片断，克隆入pAVU6+27载体上u6启动子下游27bp后，经DNA限制性内切酶图谱分析和测序证明成功构建了针对Tim-1的siRNA表达载体。真核表达载体pTARGETim-IHA与siRNA表达载体共转染肝癌细胞系HepG2。转染72h后，RT-PCR结果表明在mRNA水平，siRNA表达载体可抑制Tim-1HA的表达，实验组与阴性对照组之间的Tim-IHA的水平均不同。Western blot检测证实其在蛋白质水平上亦有良好抑制效果。 3．成功制备小鼠ConA急性肝炎模型 小鼠C0nA急性肝炎模型血清ALT水平为334±40 U/L，显著高于对照组小鼠(41±15U/L)。光镜下观察可见肝细胞变性，肝内大量淋巴细胞浸润，可见点、灶状坏死，生理盐水注射小鼠肝组织未见任何变化。 4．实时定量PCR分析不同小鼠肝组织Tim-1、Tim-2和Tim-3的表达 利用最低循环数值(ct)比较法检测目的基因的表达，结果表明在ConA急性肝炎模型小鼠肝组织中Tim-l及Tim-3表达升高，而Tim-2表达水平低于生理盐水对照鼠。HBV转基因鼠Tim-3表达水平显著高于同品系对照鼠，Tim-2表达较对照降低。 结论： 1.成功构建可表达Tim-1HA融合蛋白的真核表达载体，并首次将RNAi技术应用于Tim家族分子的研究，成功构建有效抑制Tim-1表达的siRNA表达载体，为进一步研究Tim家族分子在免疫系统中的作用提供新的实验工具。 2．首次利用实时定量PCR的技术检测Tim家族分子在ConA小鼠急性肝炎模型和转基因鼠肝组织中的表达，结果显示在ConA急性肝炎模型小鼠肝组织中Tim-1、Tim-3表达升高而Tim-2表达水平降低，提示该模型中存在T细胞大量活化，且以Thl应答为主。转基因鼠研究显示HBV感染可增强Tim-3表达水平，提示Tim-3在机体抗HBV免疫中可能发挥重要作用。

目录

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符号说明（按字母顺序排列）

前言

第一部分真核表达载体pTARGETim-1HA的构建及特异性抑制Tim-1表达的siRNA表达载体的构建

第二部分Tim家族分子在小鼠肝炎模型中表达的初步研究

小结

展望

参考文献

附图

附录质粒物理图谱

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致谢