小胶质细胞介导的皮层神经元膜电位改变在弥漫性轴索损伤中的作用

摘要

目的：弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury，DAI)以白质神经束多发性小损伤为特征，主要临床表现为深度昏迷。轴索损伤后修复的研究已经有100多年历史，但其具体机制仍不明确。DAI常伴有神经源性肺水肿、肌张力异常以及癫痫等多种并发症，在法医学检案中伤者的赔偿请求往往因客观证据不足而引起司法纠纷。因此明确弥漫性轴索损伤的具体机制对DAI的治疗和法医学检案具有重要的意义。
　　小胶质细胞作为中枢神经系统(CNS)最主要的免疫介质，在神经元变性和再生，炎症性疾病以及脑外伤中均发挥了重要的作用。小胶质细胞的激活被认为是脑损伤的核心炎症反应之一，Wasserman等研究发现，当中枢神经系统有损伤时小胶质细胞经过复杂的“活化”过程和“形态”改变，于出血损伤的周边区域形成一个小胶质细胞稠密带。本科室以往研究证实了持续活化的小胶质细胞在DAI中发挥了促损伤的作用，而细胞生物电是细胞生命活动的基础，Mandolesi G认为电活动在神经元的再生和修复中起着重要作用，基于以上原因本实验拟研究在弥漫性轴索损伤后，小胶质细胞对皮层神经元胞体的静息电位、动作电位影响，从而进一步探讨小胶质细胞在弥漫性轴索损伤中的作用机制。
　　方法：应用Marmarou A自由落体撞击方法建立大鼠DAI模型。本实验采用雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重280-320g，随机分为正常对照组；假手术组；打击不同时间组(6、12、24、48、72、120h)；米诺环素+打击组。观察打击后大鼠的行为学表现，应用HE染色和银染的方法确定大鼠DAI模型建立成功。大鼠处死后，冰上快速断头取脑，震动切片机制取额叶皮层脑片(400μm厚)，采用全细胞电流钳记录模式，观察额叶皮层神经元的静息电位和动作电位的变化情况。
　　应用Clamp fit10.0(Axon Instruments)、Origin7.5和Microsoft Excel进行数据的采集和分析。数据用均数±标准误(Mean±S.E.)表示，用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析。各组均数间的比较行单因素方差分析(ANOVA)，用最小显著差法(least significant difference，LSD)作两两比较。P＜0.05为有显著性差异。
　　结果：
　　1、成功建立了弥漫性轴索损伤模型；
　　打击后，大鼠即刻出现呼吸暂停和昏迷，平均呼吸暂停时间为15.17±3.73s，平均昏迷时间为6.35±1.11min。根据大鼠行为学评分标准，损伤组大鼠各项指标均不同程度的下降，平均分数为6.09±1.21。
　　HE染色结果：正常对照组和假手术组的大鼠脑干组织结构清晰，无水肿、出血；打击组大鼠，24h、48h时脑干部位神经元水肿明显，组织结构疏松(Fig1)；
　　Bielschowsky’s镀银染色轴索的形态学变化：正常对照组与假手术组的大鼠神经元轴突排列整齐，表面光滑；打击组大鼠，24h时神经轴索断裂、肿胀、弯曲变形，呈串珠样改变，可见轴索收缩球。
　　2、损伤组各时间点皮层神经元膜电位的变化情况(Fig2)；
　　打击12h、24h组，30个皮层神经元中，86％、83％的细胞胞膜静息电位为-63.03±0.81mV，动作电位发放频率达14.43±0.65/1000ms，峰振幅降低为89.25±3.26mV，与对照组相比有统计学意义(p＜0.05)；应用小胶质细胞抑制剂米诺环素后，77％、70％的神经元各项指标明显改善(Fig5，(Fig6)。
　　打击48h组，30个皮层神经元中，77％的细胞胞膜静息电位为-72.16±0.51mV，峰振幅为106.5±1.92mV，与对照组相比无统计学意义；而动作电位发放频率高达11.8±0.67/1000ms，神经元仍表现出一定的兴奋性，与对照组相比有统计学意义(p＜0.05)；米诺环素可明显抑制神经元兴奋性，与打击48小时组相比，86％的细胞具有统计学意义(Fig7)。
　　打击72h组，30个皮层神经元中，73％细胞处于明显的超极化状态，静息电位达-76.3±0.8mV，峰振幅为112.67±2.54mV，与对照组相比有统计学意义(p＜0.05)；应用米诺环素后，90％细胞超极化状态具有明显改善(Fig8)。
　　结论：采用Marmarou A自由落体撞击方法成功复制了大鼠弥漫性轴索损伤模型；通过应用小胶质细胞抑制剂米诺环素对比观察皮层神经元静息电位、动作电位的变化，我们推测持续活化的小胶质细胞在DAI中发挥了兴奋性毒性促损伤作用。