体细胞核移植胚胎和皮肤成纤维细胞来源干细胞的相关技术研究

摘要

目的：⑴研究不同核移植方法对小鼠体细胞核移植效率的影响，建立一种简单有效的核移植方法。⑵探讨单一和联合化学激活方法对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响。⑶比较一步法和二步法两种培养系统对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响，确立一种有效的培养系统。⑷利用微卫星DNA技术进行体细胞核移植囊胚的鉴定。⑸探讨小鼠体细胞核移植胚胎ES细胞样集落分离和培养方法，比较不同因子对建立核移植胚胎ES细胞样集落效率的影响。⑹体外诱导小鼠成纤维细胞重编程为多能胚胎干细胞样集落。 方法：⑴以小鼠颗粒细胞作为体细胞核移植的供核细胞，采用四种去核方法(盲吸法、蔗糖辅助去核法、化学去核法、荧光染色去核法)研究卵母细胞去核率的差异，并比较了胞质内注射法和反向核移植法应用于小鼠体细胞核移植的效果。⑵构建小鼠核移植胚胎。分别使用单一激活剂钙离子载体(A23187)、乙醇(Eth)、氯化锶(SrCl2)及联合蛋白激酶抑制剂6-DMAP、CB激活。⑶构建小鼠核移植胚胎。激活后，随机分为两组。第1组，比较核移植胚胎在KSOMgAA，KSOMgAA/KSOMgAA，cleavage medium andcleavage medium/blastocyst medium中的发育情况；第2组，观察牛黄酸对核移植胚胎发育影响。⑷提取近交系小鼠体细胞核移植囊胚、供体BALB/c小鼠、受体C57BL/6小鼠及昆明小鼠的基因组DNA，使用巢式聚合酶链反应扩增4个微卫星位点DNA片段，即D3Mit28，D11Mit258，D12Mit136及D14Mit50。⑸构建小鼠体细胞核移植胚胎。当核移植胚胎培养至早期囊胚阶段，移至小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，换成ES细胞培养液继续培养4～5d，分离消化ICM，重新接种。2 d后分离出ES样细胞集落，进行形态学观察。⑹分别将Pou5f1，Sox2，c-Myc和Klf4真核表达载体转染NIH3T3细胞。分离小鼠成纤维细胞，移至小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，取转染后的上清液培养。3d后，加入G418，筛选克隆2～3w。 结果：⑴荧光染色法的去核率(88％)显著高于其他试验组(P<0.05)；胞质内注射法的囊胚率和囊胚细胞数较反向核移植高(P<0.05)。⑵10mmol/L SrCl2处理6 d可获得较高卵裂率(68.9％)和囊胚率(7.2％)(P<0.05)，也较A23187、Eth组高(P<0.05)；联合激活方法中，Eth+6-DMAP+CB组(69.8％和46.05±2.62)、SrCl2+CB组(71.9％和45.40±2.23)和A23187+6-DMAP+CB组(62％和39.75±1.15)卵裂率和囊胚细胞计数明显高于未联合组(P<0.05)。⑶核移植胚胎发育的囊胚率、孵化率和囊胚细胞计数一步法和两步法培养体系中没有显著差异(P>0.05)。牛磺酸加入KSOMgAA后能有效改善早期核移植胚胎体外发育能力。⑷通过微卫星DNA序列的扩增，证明核移植囊胚的微卫星DNA与供体细胞完全相同，而与受体细胞或者对照细胞无亲缘关系。⑸ ES样细胞集落具有典型的形态学特征：集落呈鸟巢状，边缘清楚，表面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界限不清楚；单个细胞体积小、核大。碱性磷酸酶染色呈阳性。体外可分化为拟胚体，体内可分化成上皮样细胞、腺体和肌肉组织。⑹筛选初期大部分克隆形态学为扁平状，仅4株克隆为ES细胞样生长，后期克隆数增长至11株。ES细胞样克隆具有岛屿状团状隆起结构。 结论：⑴荧光染色去核法和胞质内注射法构建体细胞核移植胚胎效率较高，可维持胚胎早期发育。⑵乙醇联合6-DMAP、CB组合，SrCl2联合CB组合均能较好地激活小鼠体细胞核移植胚胎。⑶一步法和两步法培养体系均符合小鼠体细胞核移植胚胎不同发育阶段需求。⑷体细胞核移植囊胚基因组来源于供体BALB/c小鼠。⑸小鼠体细胞核移植胚胎中可以分离出ES细胞样集落。⑹四个逆转录因子Pou5f1，Sox2，Klf4和c-Myc可诱导小鼠体细胞ES细胞集落样改变。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

实验技术路线

第一部分体细胞核移植和诱导产生多能干细胞研究进展(综述)

第二部分不同核移植方法对小鼠体细胞核移植效率的影响

1材料和方法

1.1主要材料

1.2实验方法与步骤

2结果

2.1不同去核方法对小鼠卵母细胞的去核效率的影响

2.2胞质内注射法和反向核移植的核移植效果比较

3 讨论

参考文献

第三部分单一和联合化学激活方法对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响

1材料和方法

1.1主要材料

1.2实验方法与步骤

2结果

2.1单一激活方法对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响

2.2联合激活方法对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响

3讨论

参考文献

第四部分一步法和二步法培养系统对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响

1材料和方法

1.1主要试剂

1.2实验方法与步骤

2结果

2.1核移植胚胎在一步法和二步法培养系统中的发育情况

2.2牛磺酸对核移植胚胎体外发育的影响

3讨论

参考文献

第五部分近交系小鼠体细胞核移植囊胚的微卫星DNA鉴定

1材料和方法

1.1主要材料

1.2实验方法与步骤

2结果

3讨论

参考文献

第六部分体细胞核移植胚胎ES细胞样集落分离

1材料和方法

1.1主要试剂

1.2实验方法与步骤

2结果

2.1 ES细胞分离培养过程

2.2小鼠核移植重构胚中ES细胞样集落的分离培养

2.3 ntES细胞样集落生长状况

2.4 ES细胞AKP组织化学染色

2.5体内分化

2.6体外分化

3讨论

参考文献

第七部分小鼠成纤维细胞诱导产生多能干细胞

1材料和方法

1.1主要材料

1.2实验方法与步骤

2结果

2.1目的片断电泳

2.2扩增阳性克隆，质粒酶切电泳，测序

2.3转染

2.4多能干细胞样集落生长状况

3讨论

参考文献

致谢

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