L-异亮氨酸生产菌株的构建及发酵条件优化

摘要

L-异亮氨酸是八种必需氨基酸之一，在人体代谢中具有重要作用。在L-异亮氨酸的合成过程中，乙酰羟基酸合成酶催化丙酮酸和前体α-酮基丁酸生成L-异亮氨酸。由于乙酰羟基酸合成酶对α-酮基丁酸亲和性高于丙酮酸，当胞内α-酮基丁酸供应量增加时，乙酰羟基酸合成酶可优先催化生成L-异亮氨酸。同时乙酰羟基酸合成酶是L-异亮氨酸合成途径的限速酶，强化该酶可以加速限速反应，有利于L-异亮氨酸积累。
　　为了研究增加胞内α-酮基丁酸的供应和强化乙酰羟基酸合成酶对L-异亮氨酸发酵的影响，本文以L-异亮氨酸生产菌C.glutamicum YILW为出发菌株进行改造，通过质粒过表达cimA成功构建了C.glutamicum YILWpXMJ19cimA;在出发菌株基因组ilvB上游插入Ptac强启动子成功构建C.glutamicum YILWPtac;在C.glutamicumYILWPtac基础上质粒过表达cimA，获得C.glutamicum YILWPtacpXMJ19cimA。通过RT-PCR分析，cimA和ilvB的转录量分别提高了920.0倍和12.5倍。SDS-PAGE分析cimA在C.glutamicum YILWpXMJ19cimA可以表达。
　　对出发菌株和改造菌进行摇瓶补料分批发酵比较改造菌产酸水平的变化。结果发现，与出发菌C.glutamicum YILW相比，YILWpXMJ19cimA和YILWPtac的L-异亮氨酸积累量提高了8.9％和14.8％，糖酸转化率提高了17.8％和18.6％，单位菌体产酸提高了15.1％和20.3％，副产物L-丙氨酸较原菌分别降低了25.0％和29.9％。C.glutamicum YILWPtacpXMJ19cimA的L-异亮氨酸积累量较原菌提高了14.5％，副产物L-丙氨酸较原菌降低了8.6％，糖酸转化率和单位菌体产酸分别提高了42.4％和17.6％，糖酸转化率较YILWpXMJ19cimA和YILWPtac分别提高了20.8％和20.0％。实验结果表明通过Ptac强启动子插入协同cimA表达增加胞内α-酮丁酸的供应和强化限速酶乙酰羟基酸合成酶的方法可以提高产酸，并能够较明显的提高菌体的糖酸转化率。代谢分析表明L-异亮氨酸合成代谢流从1.09％分别提高到2.33％、7.69％和4.26％。
　　5L发酵罐发酵实验出现菌体在20 h过早地进入稳定期，并表现出生长停滞，耗糖耗氧变慢的情况。针对该现象在发酵过程中依次流加了豆饼水解液、玉米浆、生物素、氨基酸复合液、嘌呤核苷、酵母粉及微量元素等多种营养物质。结果菌体生物量低的问题依然没有解决。通过流加实验排除了流加的成分是菌体生长的限制因素，猜测可能是玉米浆中的某种或某几种未知的营养因子限制菌体生长和产酸。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 引言

1．2 L-异亮氨酸的理化性质及应用

1．2．1 L-异亮氨酸的理化性质

1．2．2 L-异亮氨酸的应用

1．3 L-异亮氨酸的生产方法及生产概况

1．3．1 L-异亮氨酸生产方法

1．3．2 L-异亮氨酸生产概况

1．4 L-异亮氨酸的生物合成途径及调节机制

1．4．1 L-异亮氨酸生物合成途径

1．4．2 L-异亮氨酸生物合成的调节机制

1．5 L-异亮氨酸生产菌的常规育种思路及育种实例

1．5．1 常规育种思路

1．5．2 常规诱变育种实例

1．6 代谢工程理论在构建L-异亮氨酸生产菌中的应用

1．6．1 基于代谢工程理论的L-异亮氨酸工程菌的构建思路

1．6．2 分子研究进展

1．7 基于α-酮基丁酸节点处的代谢流研究

1．8 利用发酵优化提高L-异亮氨酸发酵生产

1．9 论文的立题背景和研究内容

1．9．1 立题背景

1．9．2 本论文的主要研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株

2．2 主要仪器和试剂

2．2．1 主要仪器

2．2．2 主要试剂

2．2．3 主要溶液

2．3 实验方法

2．3．1 质粒提取

2．3．2 基因组小量提取

2．3．3 DNA限制性内切酶酶切

2．3．4 琼脂糖凝胶电泳

2．3．5 DNA的回收纯化

2．3．6 连接与化转

2．3．7 感受态细胞制备及电转化

2．3．8 PCR扩增

2．3．9 转化子鉴定

2．3．10 目的基因测序转化子鉴定

2．3．11 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

2．3．12 RT-qPCR实验

2．3．13 谷氨酸棒杆菌发酵L-异亮氨酸的培养条件及测定方法

2．3．14 高效液相色谱法定量检测发酵液中的氨基酸浓度

2．3．15 代谢流量分析

3 结果与讨论

3．1 谷氨酸棒状杆菌表达载体pXMJ19cimA的构建

3．1．1 cimA基因的扩增

3．1．2 表达载体pXMJ19cimA的构建

3．2 C．glutamicum YILWpXMJ19cimA的构建

3．3 谷氨酸棒状杆菌整合载体pK18mobsacBtac的构建

3．3．1 tac的扩增

3．3．2 插入tac序列的同源序列构建

3．3．3 谷氨酸棒状杆菌整合载体pK18mobsacBPtac的构建

3．4 C．glutamicum YILWPtac的构建

3．4．1 整合载体pK18mobsacBPtac电转整合C．glutamicum YILW

3．4．2 C．glutamicum YILWPtac的筛选

3．5 C．glutamicum YILWPtacpXMJ19cimA的构建

3．6 cimA编码蛋白的表达和Ptac强启动子的影响

3．6．1 cimA编码的异源蛋白在C．glutamicum YILWpXMJ19cimA中表达

3．6．2 Ptac强启动子对C．glutamicum YILWPtac中ilvB转录的影响

3．7 L-异亮氨酸分批发酵研究

3．7．1 cimA异源表达对C．glutamicum YILWpXMJ19cimA发酵的影响

3．7．2 启动子Ptac插入对C．glutamicum YILWPtac发酵的影响

3．7．3 启动子Ptac插入协同cimA表达对L-异亮氨酸发酵的影响

3．7．4 cimA表达与启动子Ptac插入对L-异亮氨酸发酵中副产物的影响

3．8 cimA表达协同启动子Ptac插入对L-异亮氨酸发酵影响的讨论

3．9 5L发酵罐分批发酵研究

3．10 代谢流分布比较

3．11 分批发酵优化

3．10．1 碳源的优化

3．10．2 氮源的优化

3．10．3 其它营养要素的优化

3．10．4 综合多营养策略优化

3．11 发酵优化小结

4 结论

5 展望

参考文献

7 研究生期间发表论文情况

致谢