两个抗病性增强的水稻类病变突变体基因的图位克隆及其功能的初步分析

摘要

由水稻条纹病毒(rice stripe virus，RSV)引起的水稻条纹叶枯病以及由革兰氏阴性细菌黄单胞杆菌水稻变种(Xanthomonasoryzaepv.oryzae, Xoo)引起的水稻白叶枯病(bacterial leaf blight，BLB)是水稻生产过程中两种重要的病害。尽管目前已经就这两种病害的防治和抗性品种的培育做了大量的工作，但病害依旧会悄悄卷土重来。从长期的实践来看，培育新的抗病品种和挖掘新的抗病相关基因仍是控制这些病害的最直接和最有效手段。水稻类病变突变体由于其类似于过敏性反应(hypersensitive response，HR)而出现的局部细胞死亡现象以及对于一些水稻病害的显著抗性，使其成为水稻抗病分子研究过程中一个重要的工具。我们通过乙基甲磺酸(ethyl methane sulfonate，EMS)诱变的方式获得了水稻突变体库，并从中筛选获得了两株具有类病变表型的水稻类病变突变体，暂时分别命名为Z1834和Z1828。本实验主要是分别对这两个水稻类病变突变体的目标基因进行了分子克隆，并初步分析了它们的功能。研究的主要内容如下:
　　1.依据RAP-DB数据中心(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)的水稻基因序列信息分别克隆Z1834和Z1828这两个突变体的候选基因，并通过构建超表达载体分别转化Z1834和Z1828突变体材料，以期完成功能互补实验。实验结果表明，这两个候选基因分别被确证为这两个突变体的目标基因。其中，Z1834目标基因位于9号染色体，无内含子，片段长度为2772 bp，编码一个抗性相关蛋白，基因序列中包含有一个NB-ARC结构域;而Z1828目标基因位于3号染色体，由11个外显子组成，长2022 bp，编码一个蛋白合成因子，序列中拥有RanBP2型锌指结构域和延伸因子EF1A结构域。此外，Z1828目标基因于11号染色体含有一个同源度高达98％的同源基因。
　　2.通过构建含有GFP的融合表达载体，分别对两个目标基因进行原生质体细胞和烟草叶片细胞的亚细胞定位。实验结果表明，Z1834目标基因被定位于原生质体细胞和烟草叶片细胞的细胞质内某一囊状结构内，且呈晶体状;而Z1828目标基因产物则广泛分布于细胞膜、细胞质以及细胞核内。
　　3.分别提取两个突变体材料的根、茎、叶和穗等组织中的RNA，并进行半定量PCR以便了解两个目标基因的组织特异性表达情况。结果显示，两个目标基因在水稻各组织中均有一定量的表达，其中，Z1834目标基因在水稻根中的表达量相对较低，而Z1828目标基因则在各组织中未见明显差异。
　　4.利用实时荧光定量PCR实验分别了解两个目标基因在类病变表型出现前后的表达差异。实验结果表明，在类病变表型出现之前，Z1834目标基因在突变体中的表达量与野生型材料未见明显差异，但类病变表型出现之后，突变体材料中目标基因的表达则出现了明显的升高;而Z828目标基因的表达量则恰恰相反，类病变表型出现前，其在突变体中的表达量稍高于野生型材料，但类病变表型出现后，突变体材料中目标基因的表达则出现了显著的下降，并低于野生型材料。
　　5.分别于幼苗期类病变表型未出现之前(T1)、幼苗期类病变表型出现之后(T2)以及成株期类病变表型完全出现(T3)等三个时期，对于野生型和突变体材料分别接种水稻白叶病菌P6小种，以了解两个目标基因的诱导表达情况。结果显示，Z1834目标基因同时受到物理损伤和Xoo侵染二者的影响。其中，T1期，Xoo的侵染能够诱导目标基因表达量的上升，而T2和T3期，目标基因表达量未见明显变化;Z1828目标基因则是在整个T1～T3时期均未见明显变化。
　　6.两个突变体中PR基因的表达量分析显示，Z1834突变体中，部分通路中的PR基因表达量显著升高，但PR2、PR5以及PR9等却出现了明显的下降;Z1828突变体中，绝大部分PR基因均出现了明显的上升。
　　7.TB（trypan blue，台盼蓝）和DAB（diaminobenzidine，二氨基联苯胺）染色结果显示，Z1834和Z1828突变体均在其叶片上的类病斑处出现了明显细胞死亡现象，而显微观察显示，这可能与活性氧物质(reactive oxygenspecies，ROS)的积累有关。

目录

论文说明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．1 水稻的主要病害

1．1．1 水稻条纹叶枯病

1．1．2 水稻白叶枯病

1．2 水稻抗病相关基因的挖掘及其功能研究

1．2．1 水稻抗条纹叶枯病基因的挖掘及其功能研究

1．2．2 水稻抗白叶枯病基因的挖掘及其功能研究

1．3 水稻类病变突变体

1．3．1 水稻类病变突变体概述

1．3．2 水稻类病变突变体在水稻抗病性研究中的作用

1．4 研究目的与意义

第二章 突变体Z1834候选基因的克隆

2．1 实验材料与试剂

2．2 实验方法

2．2．1 候选基因的克隆

2．2．2 表达载体的构建

2．2．3 根癌农杆菌介导的水稻遗传转化

2．2．4 转基因水稻植株的鉴定

2．3 结果分析

2．3．1 Z1834突变体的获得

2．3．2 突变体Z1834目标基因的定位及候选位点的筛选

2．3．3 突变体Z1834候选基因的克隆

2．3．4 突变体Z1834表达载体的构建

2．3．5 突变体Z1834的遗传转化

2．3．6 突变体Z1834转基因植株的鉴定

2．4 讨论

第三章 突变体Z1834目标基因功能的初步分析

3．1 实验材料与试剂

3．2 实验方法

3．2．1 目标基因的亚细胞定位

3．2．2 突变体相关的表达分析

3．2．3 突变体材料的生理分析

3．3 结果分析

3．3．1 Z1834目标基因的亚细胞定位

3．3．2 突变体材料相关的表达分析

3．3．3 病程相关基因的表达分析

3．3．4 突变体材料的生理分析

3．4 讨论

第四章 突变体Z1828候选基因的克隆

4．1 实验材料与试剂

4．2 实验方法

4．3 结果分析

4．3．1 Z1828突变体的获得

4．3．2 突变体Z1828目标基因的定位及候选位点的筛选

4．3．3 突变体Z1828候选基因的克隆

4．3．4 突变体Z1828表达载体的构建

4．3．5 突变体Z1828的遗传转化

4．3．6 突变体Z1828转基因植株的鉴定

4．4 讨论

第五章 突变体Z1828目标基因功能的初步分析

5．1 实验材料与试剂

5．2 实验方法

5．3 结果分析

5．3．1 Z1828目标基因的亚细胞定位

5．3．2 突变体材料相关的表达分析

5．3．3 病程相关基因的表达分析

5．3．4 突变体材料的生理分析

5．4 讨论

第六章 结论与展望

6．1 主要结论

6．2 创新之处

6．3 展望

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间取得的研究成果

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