虎纹蛙MHC Ⅰ类、Ⅱ类基因的克隆与多态性分析

摘要

MHC（Major histocompatibility complex）即主要组织相容性复合体，是脊椎动物中直接介导免疫反应的一类细胞表面蛋白。MHC基因即是编码这类蛋白的基因家族，许多的研究已经表明MHC基因家族是脊椎动物体内变异最大的功能基因之一，具有较高的其变异主要出现在抗原结合部位，因为该部位与动物抵抗病原体的能力以及对环境的适应性直接相关，所以很多研究集中分析这个变异最大的区域。对于MHCⅠ类、Ⅱ类基因来说，exon3与exon2分别编码其抗原结合部位，是变异最大的区域，了解该区域的变异特性能为进一步研究生态学中的适应性进化、性选择等问题提供便利。而目前两栖类MHC基因的结构特点和进化模式的研究非常有限，为了更加系统全面的了解两栖类MHC基因的多态性情况，本研究的目标是从虎纹蛙（Hoplobatrachus chinensis）中克隆MHCⅠ类exon3基因与Ⅱ类exon2基因，并分析其多态性的维持机制。
　　本文首先通过设计通用引物成功的获得了MHC基因Ⅰ类exon3126bp，MHCⅡ类exon2132bp。通过常规PCR方法以及Genomic Walking的方法共获得虎纹蛙MHCⅠ类基因1020bp，Ⅱ类基因2020bp，其中包含了全部的外显子部分。通过设计虎纹蛙特异性引物分别扩增虎纹蛙MHCⅠ类exon3与Ⅱ类exon2。然后在碧莲、大若岩与下廖三个种群中检测虎纹蛙的MHCⅠ类、Ⅱ类基因的多态性。获得了如下的研究结果:
　　1、在27个野生虎纹蛙个体中检测出Ⅰ类等位基因10条，而在一个个体中最多达到了7个，表明虎纹蛙MHCⅠ类基因最少具有4个基因座;Ⅱ类等位基因检测到7条等位基因，在一个个体中最多达到3个等位基因，表明虎纹蛙MHCⅡ类基因最少有2个基因座。
　　2、通过DNAsp软件计算出其Ⅰ类基因的10条等位基因的核苷酸序列变异位点为27.3％;Ⅱ类基因的7条等位基因的核苷酸序列变异位点为13％。
　　3、通过MEGA6.0计算所得到等位基因的氨基酸距离以及核苷酸距离，结果得到MHCⅠ类与Ⅱ类的氨基酸距离均大于核苷酸距离，暗示其经历过正选择，
　　4、利用MEGA与一些其他在线程序一共检测到Ⅰ类6个正选择位点，其中有3个位于假定的抗原结合区;Ⅱ类一共检测到5个正选择位点，其中有两个位于抗原结合区。所以，我们得出虎纹蛙的MHC基因受到的正选择作用可能与寄生虫调控的平衡选择有关。
　　5、通过构建系统进化发育树以及GRAD在线检测，均未发现有重组现象以及跨物种多态性。
　　本研究为以后虎纹蛙的后续研究提供了较好的理论基础和分子标记。1、可以作为一种与功能相关的分子标记来研究虎纹蛙的不同地理种群的地理变异，也可以将虎纹蛙和其它两栖类联系起来系统的阐释两栖类基因的进化模式。2、可以将该基因与虎纹蛙抵抗病原菌的能力联系起来，揭示虎纹蛙抗病的分子机制。3、可以用该基因与虎纹蛙的配偶选择联系起来，揭示虎纹蛙的配偶选择机制。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 MHC基因结构与功能

1．1 MHC Ⅰ类基因的分布与结构

1．2 MHC Ⅱ类基因的分布与结构

2 两栖类MHC基因多态性研究进展

2．1 两栖类MHC基因研究现状

2．2 MHC Ⅰ类基因多态性研究进展

2．3 MHC Ⅱ类基因多态性研究进展

3 MHC多态性维持机制

3．1 MHC多态性的产生

3．2 MHC基因多态性的维持

4 两栖类MHC多态性研究的应用

4．1 种群遗传多样性的分析应用

4．2 抗病能力分析中应用

5 虎纹蛙研究进展

5．1 分类地位以及分布

5．2 虎纹蛙研究进展

6 本研究的意义和目的

第二章 材料与方法

1 实验材料

1．1 样本的采集

1．2 主要仪器和设备

1．3 主要的实验试剂

2 主要实验方法的步骤

2．1 基于RNA水平的相关实验

2．2 基于DNA水平的相关实验

2．3 感受态细胞的制备

3 引物的设计

3．1 DNA水平上设计引物

3．2 RNA水平上设计引物

3．3 Genomic Walking引物设计

3．4 虎纹蛙MHC特异性引物的设计

4 虎纹蛙MHC Ⅰ类exon3的克隆

4．1 SSCP过程

4．2 PAGE割胶回收

4．3 DNA条带的再次扩增与克隆

5 虎纹蛙MHC Ⅱ类基因exon2的克隆

6 数据分析

6．1 等位基因的确定和序列的对比

6．2 计算遗传距离多样性指标

6．3 选择信号检测

6．4 重组检测

第三章 结果分析

1 虎纹蛙MHC Ⅰ 类结果分析

1．1 从RNA上设计引物得到的结果

1．2 通用引物扩增结果

1．3 Genome walking扩增结果

1．4 SSCP结果

1．5 序列多态性分析

1．6 核苷酸序列多态性分析

1．7 氨基酸序列分析

1．8 正选择位点的分析

1．9 跨物种多态性分析

1．10 重组检测

2 虎纹蛙MHC Ⅱ类基因结果分析

2．1 DNA上得到的结果

2．2 序列多态性分析

2．3 核苷酸序列多态性

2．4 选择信号的检测

2．5 跨物种多态性分析

2．6 重组检测

第四章 讨论

1 引物设计

2 基因座位数目

3 正选择

4 跨物种多态性

5 重组现象

第五章 小结和展望

1 小结

2 展望

参考文献

攻读学位期间发表的研究论文

攻读学位期间参加的科研项目

致谢

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