链霉菌TD--1代谢产生抑菌物质条件优化及分离纯化

摘要

据国际粮农组织统计，全球范围内的粮食类农作物都会遭受致病真菌的侵害，造成严重的经济损失。链霉菌作为天然抑菌物质、活性物质和抗生素等的主要来源之一，在对真菌病害的防治方面起到至关重要的作用，天然抑菌物质替代传统化学方法，成为一种新型的生物防治手段，也受到各界研究者的广泛关注，成为领域热点话题。 本论文研究结果表明，白黄链霉菌（Streptomyces Alboflavus TD-1）次级代谢产物中含有能够对灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、禾谷镰刀菌（Fusahum graminearum）、青霉菌（Penicilliumdigitatum）等多种农作物病原真菌起到抑制作用的活性产物。为实现链霉菌S.Alboflavus TD-1活性抑菌物质的规模化及工业化生产，本课题通过单因素实验，考察了不同工业碳源与氮源对S.Alboflavus TD-1活性抑菌物质产量的影响，结合牛津杯、薄层色谱与高效液相色谱等定性与定量分析方法发现工业碳源中马铃薯淀粉对S.Alboflavus TD-1发酵代谢活性抑菌物质促进能力最强，其次为可溶性淀粉;对发酵代谢产量促进效果最大的氮源为黄豆粉，其次为豆饼粉。其中，牛津杯法测得其对指示菌的抑菌率为66.7％，最佳的工业发酵培养基组分为:黄豆粉10g/L，马铃薯淀粉20g/L，硝酸钾1g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，可溶性淀粉20g/L，氯化钠0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.001g/L。经优化后的抑菌率达到73.97％，比未优化时提高了38％。 本论文采用高速逆流色谱（High-speed Countercurrent Chromatography，HSCCC）对S.Alboflavus TD-1次级代谢物质进行分离纯化，研究Solsel软件辅助法筛选9种不同的溶剂分离体系，调整抑菌物质在不同体系中的分配比例，确定正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=1∶6∶1∶5，转速850r/min，温度25℃，流速5min/mL为分离S.Alboflavus TD-1发酵抑菌产物的最优条件，分离得到的5种组分，其中2号组分有较强的抑菌性，用高效液相色谱法检测显示组分较纯，表明HSCCC可以对S.Alboflavus TD-1代谢产物进行快速、高通量的样品制备。 本论文采用傅里叶红外光谱仪和高分辨IT-TOF液质联用仪对2号组分进行检测鉴定。发现2号组分除C、H、O元素外不含有其他基团元素，含有4种化合物，分子量分别是633.3997、633.4000、633.3961、633.3993，推测是结构相似的同类物质，推测可能化合物的化学式为C36H56O9。

目录

声明

摘要

1前言

1．1链霉菌

1．1．1链霉菌的种类及生长方式

1．1．2链霉菌的代谢活性产物

1．2真菌病原菌

1．2．1侵染方式

1．2．2真菌病原菌的致病因子

1．2．3农作物真菌病害的防治

1．3工业培养基

1．4现代分离方法与技术

1．4．1萃取分离法

1．4．2色谱分离法

1．5．1高效液相色谱检测

1．5．2傅立叶红外光谱检测

1．5．3 LC-IT-TOF液相质谱检测

1．6论文研究的目的和研究内容

1．6．1论文研究的目的

1．6．2论文研究的内容

2材料与方法

2．1．1菌种

2．1．2实验药品及试剂

2．1．3主要仪器设备

2．2．1培养基的制备

2．2．2链霉菌TD-1培养方法

2．2．3不同工业碳氮源对链霉菌TD-1发酵产物抑菌性的影响

2．2．4链霉菌抑菌物对常见农作物致病菌的抑制作用

2．2．5链霉菌抑菌物质的分离方法

2．2．6链霉菌抑菌物质的检测方法

2．2．7链霉菌抑菌物质的结构鉴定方法

3结果与讨论

3．2不同氮源对白黄链霉菌TD-1代谢产物抑菌性的影响

3．3不同工业碳氮源的薄层层析结果

3．3．1不同工业碳源发酵培养的薄层层析结果

3．3．2不同工业氮源发酵培养的薄层层析结果

3．4链霉菌抑菌物对常见农作物致病菌的抑制作用

3．5高速逆流溶剂体系的选择结果

3．6高速逆流色谱分离结果

3．7对已分离出的组分进行活性抑菌鉴定

3．8酶标仪检测分离组分全波长扫描结果

3．9高效液相色谱检测分离组分结果

3．10傅里叶红外光谱检测分离组分结果

3．11液相色谱与质谱联用检测结果

4结论

5 展望

参考文献

7攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢