胰岛素和类胰岛素生长因子-1不同折叠行为分子机制的研究

摘要

胰岛素和类胰岛素生长因子-1同属于胰岛素超家族。它们有共同的祖先分子(文昌鱼胰岛素类似肽)，有着很相似的一级结构和高级结构，却有着完全不同的折叠行为：类胰岛素生长因子-1 可以折叠成为两个热力学上稳定的高级结构(天然形式和错配形式。这两种形式的高级结构是不一样的，二硫键配对形式也不一样，是两个二硫键异构体)。而胰岛素则只能折叠成为一个热力学上稳定的高级结构。之前以PIP和mini-IGF-1 为模式肽的研究表明，将mini-IGF-1 B结构域氮端序列[1-9]替换胰岛素相应残基，得到的模式肽[1-9]PIP，可以折叠成为两个稳定的终产物。而将mini-IGF-1 B结构域氮端序列[1-4]替换PIP相应残基，得到的模式肽[1-4]PIP，却只能折叠成一个稳定的终产物。证明决定PIP和mini-IGF-1不同折叠行为的信息被贮藏在其氮端序列[1-10]/[1-9]中。[1-9]PIP与[1-4]PIP与的不同之处仅仅在于其B9和B10位氨基酸：前者是Ala和Glu，而后者是Ser 和 His。为了更精细定位决定PIP和mini-IGF-1 不同折叠行为的信息被贮藏在其氮端序列[1-10]/[1-9]中哪些氨基酸中，基于上述研究结论，我们构建了两个模式肽[1-4][B9A]PIP和[1-4][B10E]PIP。我们在酿酒酵母中分别表达这两个模式肽，并且将其分离纯化。并且通过CD，二硫键重排反应，氧化重折叠对其二级结构和折叠行为进行了研究。我们的结果表明：[1-4][B10E]PIP 可以在(酿酒酵母细胞)体内和体外折叠得到两个稳定形式(天然形式和错配形式)，而[1-4][B9A]PIP，只有一个。显然，类胰岛素生长因子-1 的B链氮端序列[1-4]和B9His一起可以改变胰岛素的折叠行为，使其最终得到两个稳定终产物；而胰岛素B链氮端序列[1-5]可改变类胰岛素生长因子-1 的折叠行为，使其得到一个稳定终产物。显然：类胰岛素生长因子-1 的B链氮端[1-4]和B9Glu/PIP氮端序列[1-5]和B10His是决定它们不同折叠行为的序列决定子。

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文摘

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1引言

2材料和方法

2.1实验材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2主要生化试剂

2.1.3主要仪器与设备

2.2实验方法

2.2.1质粒构建

2.2.2质粒的扩增

2.2.3模式肽的表达

2.2.4模式肽的分离纯化

2.3模式肽的分析鉴定

2.3.1 pH8.3聚丙烯酰胺凝胶电泳(pH8.3 PAGE)鉴定

2.3.2分子量鉴定

2.3.3圆二色性(CD)测定

2.4模式肽的折叠行为研究

2.4.1二硫键重排反应

2.4.2完全还原样品的体外再折叠

3结果

3.1质粒构建：

3.1.1酶切鉴定

3.1.2测序

3.2模式肽的表达

3.3模式肽的分离纯化

3.3.1三氯乙酸(TCA)沉淀发酵上清液

3.3.2 Sephadex G-50凝胶柱对模式肽的粗分离

3.3.3 DEAE-Sepharose Fast Flow纯化G-50分离产物

3.3.4 C8 RP-HPLC纯化

3.4模式肽的分析鉴定

3.4.1 pH8.3聚丙烯酰胺凝胶电泳(pH 8.3 PAGE)鉴定

3.4.2分子量鉴定

3.4.3圆二色性(CD)测定

3.5模式肽的折叠行为研究

3.5.1二硫键重排反应

3.5.2完全还原样品的体外再折叠

4讨论

5结论

参考文献

致谢

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