拟甘露糖牛血清白蛋白荧光探针的制备及受体标记研究

摘要

细胞表面覆盖的致密的糖链主要以糖脂和糖蛋白形式存在，并通过“糖簇效应”与其受体蛋白相互识别，进而在细胞黏附、细胞识别、细胞增殖、病毒和细菌入侵宿主细胞、免疫系统应答等多种生理和病理过程中发挥重要作用。通过模拟细胞表面的糖蛋白，开发荧光探针研究糖—蛋白之间的相互作用和随后引发的一系列调控过程是阐明细胞生物高级生命活动的关键。本课题以荧光稳定、高效的异硫氰酸荧光素(FITC)为荧光分子，以无非特异性吸附、生物相容性好、低毒的牛血清白蛋白(BSA)为骨架，以甘露糖(Man)为糖配体，设计合成新型荧光探针(BFM)，以其作为一种有效的工具研究糖-受体相互作用以及肿瘤细胞靶向。 对合成的拟甘露糖蛋白荧光探针，首先通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)表征蛋白表面所缀合的FITC和Man的数量，分别为1和10。表面等离子共振(SPR)实验表明拟甘露糖蛋白荧光探针保留了甘露糖配体识别特异性，并表现出强亲和力，KD=400nM。微阵列(Microarray)实验中浓度为1mg/mL时实验组荧光强度是对照组的3倍，表明拟甘露糖蛋白荧光探针可以在分子水平上标记甘露糖受体，进一步通过荧光聚集、荧光恢复实验揭示了拟蛋白荧光探针可以作为高效、稳定的工具在分子水平上研究糖-蛋白之间的相互作用。最终，大肠杆菌(106-108cells/mL)标记实验表明拟甘露糖蛋白荧光探针可以对大肠杆菌k12表面FimH甘露糖受体菌毛进行标记。并可以通过人乳腺癌细胞(MCF-7)表面的糖转运蛋白进行荧光标记。实验结果表明了本课题所合成的拟甘露糖蛋白荧光缀合物是一种应用广泛的探针，可以用来阐明在糖-蛋白之间的相互作用、并可应用于肿瘤细胞成像以及药物靶向识别特定的肿瘤细胞。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1糖类化合物概述

1．1．1糖类化合物

1．1．2糖类化合物的重要性

1．2糖簇效应

1．3荧光糖探针的研究进展

1．3．1荧光

1．3．2荧光探针及分类

1．4荧光蛋白骨架

1．5凝集素

1．6课题设计

1．7研究目的与意义

1．8主要研究内容

2材料与方法

2．1实验仪器

2．2实验试剂和原料

2．3实验内容

2．3．1连接臂的化学合成

2．3．2荧光蛋白骨架的化学合成

2．3．3甘露糖荧光蛋白探针BSA-Mannose-FITC(BFM)的化学合成

2．3．4甘露糖荧光蛋白探针BSA-Mannose-FITC(BFM)的生物检测

3结果与讨论

3．1化合物的核磁结构表征

3．1．1化合物2的结构表征

3．1．2化合物4的结构表征

3．1．3化合物5的结构表征

3．1．4化合物6的结构表征

3．1．5化合物7的结构表征

3．1．6化合物8的结构表征

3．1．7化合物9的结构表征

3．1．8化合物10的结构表征

3．2化合物的红外光谱结构表征

3．2．1化合物9的红外光谱结构表征

3．2．2化合物10的红外光谱结构表征

3．3目标蛋白缀合物分子量鉴定

3．4．1表面等离子共振(SPR)实验结果与分析

3．4．2微阵列(Microarray)实验结果与分析

3．4．3荧光聚集实验结果与分析

3．4．4荧光恢复实验结果与分析

3．5．1大肠杆菌(Escherichia coli K12)识别实验结果与分析

3．5．2荧光显微镜及扫描电镜实验结果与分析

3．6人乳腺癌细胞(MCF-7)与BFM结合实验结果与分析

3．7荧光探针BFM细胞毒性实验结果与分析

4结论

4．1全文总结

4．2论文的创新点

4．3论文的不足之处

5展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢

附录