用于结肠癌个性化治疗的溶瘤腺病毒载体的构建：个性化治疗之一

摘要

结肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率在我国各类肿瘤中排在第五位，仅次于胃癌、肝癌、食管癌、肺癌等恶性肿瘤，并随着人们饮食结构的改变呈逐年上升趋势。结肠癌多发于中老年人群，但是，目前的研究显示，结肠癌的发病年龄渐趋年轻化，我国结肠癌患者的发病年龄平均在45岁左右，较欧美要提前15年，而青年癌症患者中结肠癌占23.7％。 基因-病毒病毒疗法由于结合了病毒的扩增能力和基因的杀伤作用，从而成为结肠癌生物治疗的研究热点。在运载病毒的筛选中，腺病毒载体以其宿主范围广、可感染分裂和非分裂细胞、高滴度、易纯化、外源基因装载容量大等优点，越来越广泛地被应用于肿瘤治疗。本课题组已经成功构建了溶瘤腺病毒ZD55系统，该系统由野生型腺病毒删除E1B55Kd基因改造而来，E1B55Kd蛋白在病毒扩增过程中负责拮抗p53。野生型腺病毒感染正常细胞会激活细胞内的p53途径，此时E1B55Kd蛋白抑制p53，保证宿主细胞的存活，为病毒的复制维持提供一个稳定的微环境。而删除掉E1B55Kd基因后，由p53诱导，机体迅速清除受ZD55感染的正常细胞，由于多数肿瘤细胞内均存在p53途径缺失，ZD55系统能选择性的在肿瘤细胞内扩增。但是大多数腺病毒载体都存在靶向性差，毒副作用强等缺点，极大的限制了溶瘤腺病毒的应用。因此，进一步提高溶瘤腺病毒的靶向性，降低对细胞的毒性成为溶瘤腺病毒开发的关键。目前，提高溶瘤腺病毒靶向性的方法主要有两种：其一改变病毒的外壳蛋白，使病毒只能感染肿瘤细胞；其二调控病毒的增殖，使病毒只能在肿瘤细胞内复制。后者最常用的方法是修改病毒基因组，或是利用一些肿瘤特异性的启动子来调控病毒DNA的复制，使病毒只能选择性的在肿瘤细胞内增殖。 以此理论为基础，我们利用癌胚抗原启动子替换ZD55的E1A的启动子，成功构建出溶瘤腺病毒ZD55-CEA。CEA具有较强的结肠癌特异性，是结肠癌诊断及预后的重要指标，研究显示结肠癌病人血清中CEA的含量高达60ng/mL。为了进一步提高结肠癌的治疗效果，本研究将大肠癌负相关基因ST13插入溶瘤腺病毒ZD55-CEA中，构建了携带ST13基因表达框的溶瘤腺病毒CEA-E1A-ZD55-E1B-ST13。和传统的杀伤基因相比，ST13的靶向性更为专一，目前的研究显示，各类肿瘤中只有大肠癌的发生与ST13的表达水平存在负相关性。我们针对ZD55-CEA的靶向性及CEA-E1A-ZD55-E1B-ST13对不同细胞的杀伤效果作了体外试验，结果显示ZD-CEA在结肠癌细胞内能够快速的增殖，而在正常细胞内无明显变化，在CEA非高表达的肿瘤细胞内增殖缓慢；CEA-E1A-ZD55-E1B-ST13对结肠癌癌细胞具有选择性杀伤效果，而对正常细胞无毒害作用。CEA-E1A-ZD55-E1B-ST13的成功构建实现了结肠癌的‘个性化’治疗目的，并为基因-病毒疗法的进一步精确化建立一个新平台。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

1.引言

1.1结肠癌的治疗背景

1.1.1结肠癌的传统疗法

1.1.2结肠癌常用的生物疗法

1.2用于结肠癌治疗的溶瘤腺病毒载体

1.2.1溶瘤腺病毒的基本特征

1.2.2溶瘤腺病毒的选择原则

1.2.3溶瘤腺病毒的改造方案

1.3结肠癌个性化生物治疗

1.3.1大肠癌肿瘤特异性启动子的筛选

1.3.2大肠癌负相关基因的筛选

1.4本研究的创新之处及主要特色

2实验材料

2.1生化试剂

2.2培养基及细胞培养液

2.2.1 LB/TB培养液及培养基

2.2.2细胞培养液

2.3菌株和质粒

2.4细胞株系及培养条件

2.5主要仪器与设备

2.6引物合成

3.实验方法及步骤

3.1载体ZD-CEA的构建

3.1.1质粒pMD18-T-CEA的构建

3.1.2质粒pXC2-CEA的构建

3.1.3质粒ZD55-CEA的构建

3.2携带对照报告基因EGFP的CEA-E1A-ZD55-E1B-EGFP载体的构建

3.3携带对照杀伤基因IL-24的CEA-E1A-ZD55-E1B-IL-24载体的构建

3.4携带目的治疗基因ST13的CEA-E1A-ZD55-E1B-ST13载体的构建

3.5病毒的构建

3.5.1贴壁细胞HEK293的培养

3.5.2同源重组构建腺病毒

3.5.3病毒CEA-E1A-ZD55-E1B-EGFP的PCR鉴定

3.5.4病毒CEA-E1A-ZD55-E1B-IL-24的PCR鉴定

3.5.5病毒CEA-E1A-ZD55-E1B-ST13的PCR鉴定

3.5.6病毒DNA的抽提

3.5.7病毒的挑空斑纯化

3.6病毒基因表达实验

3.6.1病毒CEA-E1A-ZD55-E1B-EGFP在HEK293中出现空斑

3.6.2绿色荧光蛋白(GFP)表达分析

3.7病毒载体的结肠癌细胞特异性增殖检测

3.8 CEA-E1A-ZD55-E1B-ST13对结肠癌选择性杀伤效果的检验

4.实验结果与分析

4.1载体构建(示意图如附录一)

4.1.1重组质粒pMD18-T-CEA的酶切及PCR鉴定结果

4.1.2肿瘤特异性启动子CEA的测序结果

4.1.3重组质粒pXC2-CEA的PCR鉴定结果

4.1.4重组质粒ZD55-CEA的PCR鉴定结果

4.2携带报告基因EGFP的载体CEA-E1A-ZD55-E1B-EGFP的鉴定

4.3携带对照杀伤基因IL24的载体CEA-E1A-ZD55-E1B-IL-24的鉴定

4.4携带治疗基因ST13的载体CEA-E1A-ZD55-E1B-ST13的鉴定

4.5病毒鉴定

4.5.1病毒CEA-E1A-ZD55-E1B-EGFP的鉴定结果

4.5.2病毒CEA-E1A-ZD55-E1B-IL24的鉴定结果

4.5.3病毒CEA-E1A-ZD55-E1B-ST13的鉴定结果

4.5.4CEA-E1A-ZD55-E1B-ST13及CEA-E1A-ZD55-E1B-EGFP的空斑纯化结果

4.6病毒CEA-E1A-ZD55-E1B-EGFP在HEK293中荧光表达

4.7病毒载体在结肠癌细胞中特异性表达

4.7.1病毒CEA-E1A-ZD55-E1B-EGFP在不同细胞内的扩增情况

4.7.2病毒CEA-E1A-ZD55-E1B-ST13对不同细胞的杀伤作用

5.讨论

6.结论

参考文献

附录

致谢