辐射胁迫与过氧化氢氧化胁迫下耐辐射动球菌中RecBCD与FMN riboswitch的功能研究

摘要

耐辐射动球菌（Kineococcus radiotolerans，Kradiotolerans）是耐强碱、耐高盐、耐高金属离子浓度，耐高化学毒性、耐高渗透压以及γ射线的革兰氏阳性抗辐射菌，由核污染物废料中分离得到。耐辐射动球菌的辐射抵抗性主要是由于其超强的DNA修复能力，RecBCD是大肠杆菌中起始同源重组来修复DNA双链断裂损伤的蛋白复合体，由RecB、RecC、RecD三个亚基组成。核糖开关(Riboswitch)具有RNA结构，是位于mRNA5'非编码区的RNA传感器。在无任何蛋白质因子参与下，可特异性地直接结合代谢产物，使自身构象发生相应变化，启动或阻断mRNA的转录、翻译、拼接等过程来调控基因的表达。K.radiotolerans在环境保护和生物修复领域具有极大的应用前景，但目前对于该菌的研究还较少。结合课题组前期对该菌进行的转录组测序（原始菌株与4.5 kGy辐照处理）获得的数据，本论文对在辐射胁迫与过氧化氢氧化胁迫下，对耐辐射动球菌中RecBCD与FMN riboswitch分别在抗辐射、抗氧化方面进行了研究。
　　K.radiotolerans经过过氧化氢(40 mM)氧化处理4h后再于正常状态下分别进行培养，培养0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h后收集菌体并提取总RNA，经逆转录得到cDNA作为模板，利用qRT-PCR方法进行FMN riboswitch表达量变化情况分析。实验结果发现，FMN riboswitch在受到H2O2的氧化胁迫后其表达量发生变化，呈现出先下调后上调，最后恢复至正常水平，这说明FMN riboswitch与K.radiotolerans的DNA损伤修复存在一定关联。利用体外重叠延伸PCR技术尝试构建K.radiotolerans FMN riboswitch缺失株时，建立了K.radiotolerans体外重叠PCR体系，将4段目的片段按照预期顺序成功拼接。
　　利用SWISS-MODEL对K.radiotolerans中RecB、RecC和RecD进行同源模建，模建其蛋白三级结构的3D模型，这为K.radiotolerans RecBCD的进一步研究提供一定的帮助。对K.radiotolerans进行辐照处理(辐照剂量梯度:0 kGy、2 kGy,4 kGy、6 kGy、8 kGy,10 kGy、12 kGy)4 h后，收集菌体提取总RNA并逆转录成cDNA，利用qRT-PCR对RecBCD进行表达量水平的研究。实验结果显示RecB、RecC、RecD在各处理样本中的表达量变化趋势随着辐照剂量的升高而上升，这表明RecBCD与K.radiotolerans的辐射抗性有一定的关联，结合RecBCD在大肠杆菌中其修复DNA的方式，推测RecBCD在K.radiotolerans的双链DNA断裂修复过程中发挥了重要的作用。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略表

第一章 绪论

1．1 耐辐射动球菌

1．1．1 耐辐射动球菌的基本特性

1．1．2 耐辐射动球菌的全基因组序列

1．1．3 耐辐射动球菌辐射抗性研究

1．1．4 耐辐射动球菌耐干旱性研究

1．1．5 耐辐射动球菌的研究进展与应用前景

1．2 黄素单核苷酸核糖开关(FMN riboswitch)

1．2．1 FMN riboswitch的结构特征

1．2．2 FMN riboswitch的主要调节机制

1．2．3 FMN riboswitch的研究进展

1．3 RecBCD蛋白及其相关DNA修复途径

1．4 sRNA及其调控机制

1．5 课题的立题依据及意义

第二章 耐辐射动球菌FMN riboswitch的生物信息学分析

2．1 研究方法

2．2 结果和分析

2．2．1 FMN riboswitch在耐辐射动球菌基因组中的位置以及基本特性

2．2．2 FMN riboswitch保守序列的分析

2．2．3 FMN riboswitch物种同源性分析

2．2．4 耐辐射动球菌中FMN riboswitch二级结构的预测与分析

2．2．5 耐辐射动球菌中FMN riboswitch的靶基因预测

2．3 小结

第三章 氧化胁迫下耐辐射动球菌中FMN riboswitch表达变化

3．1 材料与方法

3．1．1 菌种与培养条件

3．1．2 主要试剂与仪器

3．1．3 荧光定量引物设计

3．1．4 耐辐射动球菌的氧化处理

3．1．5 提取耐辐射动球菌RNA

3．1．6 RNA样品中基因组DNA的消除

3．1．7 反转录反应

3．1．8 荧光定量PCR反应检测FMN riboswitch表达差异

3．2 结果与分析

3．2．1 RNA质量检测结果

3．2．2 荧光定量qRT-PCR检测FMN riboswitch表达差异分析

3．3 小结

第四章 耐辐射动球菌FMN riboswitch缺失突变株的构建

4．1 实验材料

4．1．1 实验菌种、重组质粒和培养条件

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器设备

4．2 实验方法

4．2．1 构建FMN riboswitch缺失株

4．2．2 重叠延伸PCR引物信息

4．2．3 耐辐射动球菌基因组的提取

4．2．4 PCR法扩增目的基因片段

4．2．5 目的DNA片段的纯化与回收

4．2．6 重叠延伸PCR获取连接目的片段

4．2．7 耐辐射动球菌的感受态细胞制备与转化

4．3 实验结果与分析

4．3．1 耐辐射动球菌基因组DNA的浓度与质量

4．3．2 PCR获得的目的片段

4．3．3 重叠延伸PCR连接各目的片段

4．3．4 筛选突变株

4．4 小结

第五章 耐辐射动球菌中RecBCD的生物信息学分析

5．1 材料与方法

5．2 结果分析

5．2．1 RecBCD在K．radiotolerans基因组中的位置和基本特征

5．2．2 RecBCD蛋白理化性质分析

5．2．3 RecBCD蛋白的疏水性分析

5．2．4 RecBCD蛋白的二级结构预测与分析

5．2．5 同源模建RecBCD蛋白的三级结构与分析

5．2．6 预测可能参与调控RecBCD表达的sRNA

5．3 小结

第六章 RecBCD与sKRA 051、sKRA 059的共表达情况

6．1 材料和试剂

6．1．1 材料与仪器

6．1．2 试剂

6．2 实验方法

6．2．1 菌体活化与辐照处理

6．2．2 qRT-PCR引物设计

6．2．3 耐辐射动球菌总RNA的制备与质量检测

6．2．4 RNA样品中基因组DNA的消除

6．2．5 反转录反应

6．2．6 验证RecB、RecC、RecD由同一个操纵子进行基因表达

6．2．7 qRT-PCR分析不同辐照剂量处理下RecBCD与sKRA 051、sKRA 059的共表达差异情况

6．2．8 qRT-PCR数据处理方法

6．3 结果分析

6．3．1 总RNA的检测结果

6．3．2 验证RecB、RecC、RecD由同一个操纵子进行基因表达实验结果

6．3．3 qRT-PCR分析辐射抗性相关差异表达基因

6．4 小结

第七章 总结与展望

参考文献

附录

攻读学位期间的科研成果

致谢