猪圆环病毒2型Cap蛋白多克隆抗体的制备及稳定表达细胞株的建立

摘要

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus2，PCV2)是引起断乳猪多系统衰竭综合征等多种疾病的主要病原体，病毒的主要衣壳蛋白Cap在体外可自组装成病毒样颗粒。研究表明Cap蛋白与补体蛋白C1q膜受体gC1qR、动力蛋白轻链DYNLL1等蛋白存在相互作用，影响病毒复制及细胞功能。关于Cap蛋白互作蛋白的研究有助于了解PCV2感染的分子机制。因此对PCV2病毒的Cap蛋白的互作蛋白的研究具有重要意义。
　　本研究根据GenBank中PCV2基因序列，设计cap基因特异性引物，PCR扩增该基因，构建重组Cap蛋白的原核表达质粒pET-28a-Cap，大量诱导表达、纯化重组蛋白，免疫新西兰大白兔，获得Cap蛋白的多克隆抗体。设计一对包含attB重组位点的cap基因特异性引物，PCR扩增获得带有attB1和attB2位点的cap基因片段，利用Gateway技术构建真核稳定表达质粒pDEST-SFB-Cap，转染PK-15猪肾细胞，利用嘌呤霉素筛选，获得携带SFB标签的稳定表达重组Cap蛋白的PK-15细胞株。免疫共沉淀和Western bolt检测到重组Cap蛋白的表达。间接免疫荧光检测发现重组Cap蛋白在部分细胞内呈点状荧光分布，可能形成病毒性颗粒;流式细胞仪检测表明Cap蛋白的表达可诱导PK-15细胞凋亡。成功获得Cap蛋白的多克隆抗体和建立携带SFB标签的Cap蛋白的稳定表达PK-15细胞株，为下一步通过串联亲合纯化/质谱方法鉴定Cap蛋白的互作蛋白研究奠定基础。

目录

声明

摘要

缩略语

第一章 绪论

1 引言

2 猪圆环病毒分子生物学

2．1 病毒主要基因及其编码蛋白

2．2 病毒的复制

3 猪圆环病毒相关疾病

3．1 断乳仔猪多系统衰竭综合征

3．2 猪皮炎肾病综合征

3．3 猪呼吸道疾病综合征

3．4 生殖障碍

3．5 渗出性表皮炎

3．6 坏死性淋巴结炎

4．1 树突状细胞

4．2 T淋巴细胞

4．3 细胞因子

5 猪圆环病毒2型分子致病机制

5．1 病毒复制

5．2 猪圆环病毒与细胞信号传导

5．3 病毒与氧化应激反应

5．4 细胞miRNA参与猪圆环病毒感染

5．5 猪圆环病毒与细胞凋亡

5．6 猪圆环病毒与细胞自噬

6 蛋白质相互作用

6．1 与PCV2 Cap蛋白相互作用的细胞蛋白

6．2 与PCV2 ORF3蛋白相互作用的细胞蛋白

第二章 实验方案

1 研究目的和意义

2 研究的主要内容

3 技术路线

第三章 猪圆环病毒2型Cap蛋白多克隆抗体的制备

1 材料

1．1 菌株质粒

1．2 试剂

1．3 实验仪器

1．4 主要试剂的配制

2 方法

2．1 cap目的基因片段的扩增

2．2 目的蛋白的诱导表达

2．4 蛋白纯化

3 结果

3．1 原核表达载体pET-28a-Cap的构建

3．2 Cap重组蛋白的表达和纯化

4 讨论

第四章 猪圆环病毒2型Cap蛋白稳定表达细胞系的构建

1 材料

1．1 菌株与质粒

1．2 材料与试剂

1．3 主要溶液的配制

2 方法

2．1 猪圆环病毒2型cap基因的克隆

2．2 嘌呤霉素筛选稳定蛋白表达细胞株

2．3 Western blot检测重组Cap蛋白表达

2．4 免疫共沉淀检测重组Cap蛋白表达

2．5 间接免疫荧光检测Cap重组蛋白表达

3．1 cap基因的PCR扩增

3．2 pDEST-SFB-Cap稳定表达载体的构建

3．3 Western bolt检测Cap重组蛋白的表达

3．4 免疫共沉淀检测Cap重组蛋白的表达

3．5 间接免疫荧光检测Cap重组蛋白表达

4 讨论

第五章 猪圆环病毒2型Cap蛋白诱导细胞凋亡

1．1 细胞

1．2 材料与试剂

1．3 主要试剂的配制

2 方法

2．1 待检测样品的制备

2．2 仪器使用

3 结果

4 讨论

参考文献

致谢