一株嗜热芽孢杆菌脂肪酶基因的克隆表达以及重组酶酶学性质和应用的研究

摘要

通过PCR得到Geobacillus stearothermophilus JC脂肪酶基因lipjC的全长，测序发现该基因包含长为1251bp的开放阅读框，编码388个氨基酸残基及一个由28个氨基酸组成的信号肽。将脂肪酶基因全长和编码成熟肽的片段同时克隆到原核表达载体pET-28a（+），将转化E.coli BL21（DE3）并在同样的条件下诱导表达后发现包含成熟肽的重组菌的表达水平（52030U/L）明显高于包含前体（12100U/L）的重组菌，说明切除信号肽能显著提高表达水平并获得更多的可溶性蛋白。 重组菌体经超声破碎，含可溶性目的蛋白的上清液通过一步固定化金属离子亲和层析得到电泳单一条带的纯酶，比活为515.6 U/㎎，活力回收率为40.5％。纯化的酶经SDS-PAGE分析，表明其大小约为43kDa，符合预期计算值。 酶学性质研究表明该重组脂肪酶反应的最佳温度为55℃，最佳pH为9.0。脂肪酶JC在许多抑制剂如EDTA、β-巯基乙醇、PMSF、DTT中都能保持稳定，Triton X-100对该酶有明显的激活作用。在1mM的终浓度下，K+，Na+，Mg2+，Ca2+、Mn2+能激活该酶，而Fe2+，Zn2+，Cu2+对酶存在抑制作用。在有机溶剂如DMSO、乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、丁酮、乙睛等存在下，脂肪酶的活力没有显著的下降，表明该脂肪酶具有较好的有机溶剂耐受性。 以重组脂肪酶JC为催化剂，进行外消旋乙酸苯乙酯的拆分研究。在25℃，R-苯乙醇转化率达到92％左右，得到eep为97.7％的R-苯乙醇，反应的对映体选择性E达236.6。

目录

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声明

第一章文献综述

1.1脂肪酶的研究现状

1.1.1脂肪酶的来源

1.1.2脂肪酶催化的反应类型

1.1.3脂肪酶的催化机理

1.1.4底物特异性

1.1.5脂肪酶活力的测定

1.1.6脂肪酶的应用

1.2酶法催化拆分α-苯乙醇的研究进展

1.2.1手性研究的意义

1.2.2拆分方法的研究概况

1.2.3 α-苯乙醇的拆分

1.2.3脂肪酶在α-苯乙醇手性拆分中的应用

1.3产热稳定性脂肪酶地细菌的相关研究

1.3.1地细菌菌属

1.3.2 Geobacillus菌属组成及其特征

1.3.3 Geobacillus菌属的生态分布

1.3.4 Geobacillus来源脂肪酶基因的克隆和表达

1.4本课题的立题依据和研究内容

1.4.1立题依据

1.4.2研究内容

第二章嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶基因的克隆和表达

2.1实验材料

2.1.1菌种、载体、试剂

2.1.2主要仪器

2.2实验方法

2.2.1 Geobacillus stearothermophilus JC基因组DNA的制备

2.2.2重组表达质粒构建策略

2.2.3 PCR扩增目的基因

2.2.4 TA克隆

2.2.5重组表达质粒的构建

2.2.6脂肪酶的表达

2.2.7表达产物SDS-PAGE分析

2.2.8脂肪酶活力测定

2.2.9蛋白质含量的测定

2.3结果与分析

2.3.1基因组DNA的获得

2.3.2 PCR扩增目的基因

2.3.3TA克隆

2.3.4重组表达载体pET28a-LIP1和pET28a-LIP2的鉴定

2.3.5表达产物的SDS-PAGE分析

2.4讨论

第三章脂肪酶JC的分离纯化及酶学性质研究

3.1实验材料

3.1.1主要试剂

3.1.2主要溶液与缓冲液

3.1.3实验菌株

3.2实验方法

3.2.1 Ni+柱亲和层析纯化重组目的蛋白

3.2.2脂肪酶JC的酶学性质研究

3.3实验结果

3.3.1脂肪酶的分离纯化

3.3.2脂肪酶JC酶学性质研究

3.4讨论

第四章 脂肪酶JC催化拆分外消旋乙酸苯乙酯的研究

4.1材料与方法

4.1.1菌种

4.1.2实验主要仪器

4.1.3实验试剂

4.1.4拆分反应

4.1.5分析方法

4.1.6拆分过程中一些参量的计算

4.2结果与讨论

4.2.1拆分前后的液相色谱图

4.2.2拆分结果的计算

4.3讨论

第五章结论与建议

5.1结论

5.2建议

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文目录

致谢