界面自组装羰基还原酶不对称还原3-羰基-3-苯基丙酸乙酯制备(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯

摘要

(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯是(R)．托莫西汀的关键手性中间体。托莫西汀(Atomoxetine)是一种选择性去甲肾上腺素再摄取抑制剂。2002年2月，该药成为第一个获美国食品与药品管理局(FDA)批准用于治疗注意缺陷多动障碍(ADHD)的非中枢兴奋药物。
　　采用实验室保藏菌种热带假丝酵母Candida tropicalis CGMCC NO.15016作为催化剂，以3-羰基-3-苯基丙酸乙酯为底物，生物法不对称还原合成(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯。以磷酸盐缓冲液/有机溶剂两相体系作为生物催化反应介质，采用二硝基水杨酸(DNS)法研究有机溶剂对细胞的耐受机制，采用气相色谱分析法确定最佳反应体系为:在磷酸盐缓冲液/邻苯二甲酸二丁酯（相体积比1∶1）两相体系中，以8％添加量的乙醇作为辅助底物，菌体浓度为30g/L（菌体干重/反应液体积），磷酸盐缓冲液pH6.0，36℃，120r/min的条件下反应48h。可将0.050mol/L的3-羰基-3-苯基丙酸乙酯转化为(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯，底物转化率及(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯对映体过剩值均可达到100％。
　　为了进一步提高底物利用率，分离纯化热带假丝酵母Candida tropicalis CGMCC NO.15016细胞内的羰基还原酶。在甲苯/Tris-HCl缓冲溶液两相体系中，将0.8g/L的羰基还原酶(180U/mg)与5.00g/L的聚苯乙烯相结合，得到界面自组装羰基还原酶(155U/mg)。以界面自组装羰基还原酶为生物催化剂，不对称还原3-羰基-3-苯基丙酸乙酯制备(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯。通过优化界面自主装酶在两相体系的转化条件，最终确定最优反应体系:在Tris-HCl/甲苯(相体积比10∶12.5)两相体系中，以10％乙醇作为辅助底物，加入0.10mol/LNADH，35℃，140r/min的条件下反应8h。可将0.056mol/L的3-羰基-3-苯基丙酸乙酯转化为(R)．3．羟基-3-苯基丙酸乙酯，底物转化率及(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯对映体过剩值均可达到100％。
　　深入研究了界面自组装酶在Tris-HCl/甲苯(相体积比10∶12.5)两相体系中催化3-羰基-3-苯基丙酸乙酯的不对称还原制备(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯的动力学过程。通过检测催化反应中产物和底物浓度变化的实验数据，拟合动力学方程，得到该反应的动力学参数为:Vm=3×10-3moL·L-1·h-1,KB=9×10-3moL·L-1·h-1,KA=7×10-6moL·L-1·h-1
　　动力学模型为:V=3.0×10-3×Cs×CNADH/9×10-3×CNADH+9×10-3×7×10-6+Cs×CNADH
　　利用该动力学模型得到的计算曲线与实验数据能较好地吻合。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

缩略词简表(Abbreviations)

1．1．1 手性及手性药物的概述

1．1．2 手性药物的药效差异

1．1．3 手性药物的制备方法

1．2 微生物转化法概述

1．2．1 微生物转化法的主要类型

1．2．2 微生物转化的主要方法及特点

1．2．3 微生物转化的影响因素

1．3 水／有机溶剂两相体系中微生物不对称还原羰基化合物

1．3．1 微生物不对称还原羰基化合物的反应机理

1．3．2 微生物不对称还原羰基化合物的辅酶再生

1．3．3 水／有机溶剂两相体系中微生物不对称还原羰基化合物

1．4 界面自组装酶生物催化

1．4．1 细胞固定化技术

1．4．2 界面自组装酶不对称还原

1．5 托莫西汀

1．5．1 注意缺陷多动障碍

1．5．2 托莫西汀概述

1．5．3 托莫西汀中间体(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯

1．6 本论文的研究内容

1．7 本论文的研究意义

第二章 有机溶剂对热带假丝酵母C．tropicalis CGMCC NO．15016毒性研究

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 菌种

2．2．2 试剂与仪器

2．2．3 培养基

2．3 实验及分析方法

2．3．1 培养方法

2．3．2 DNS法测定葡萄糖浓度

2．3．3 有机溶剂对细胞毒性的检测方法

2．3．4 底物对细胞的毒性实验

2．3．4 底物与产物的分析方法

2．3．5 数据处理方法

2．4 结果与讨论

2．4．1 葡萄糖标准曲线

2．4．2 不同有机溶剂对细胞的毒性

2．4．3 细胞的代谢活力与log P值关系

2．4．4 有机溶剂对不同生长期细胞的毒性

2．4．5 底物对细胞代谢活力的影响

本章小结

第三章 水／有机溶剂两相体系中不对称还原制备(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 菌种

3．2．2 试剂与仪器

3．2．3 培养基

3．3 实验方法

3．3．1 培养方法

3．3．2 分析方法

3．3．3 热带假丝酵母C．tropicalis CGMCC NO．15016还原转化反应条件优化

3．4 结果与讨论

3．4．1 不对称还原转化反应条件优化结果

3．4．2 两相体系与单一水相体系的比较

本章小结

第四章 界面自组装羰基还原酶不对称还原制备(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 菌种

4．2．2 试剂与仪器

4．2．3 培养基

4．3 实验方法

4．3．1 培养方法

4．3．2 分析方法

4．3．3 羰基还原酶的制备

4．3．4 界面自组装羰基还原酶的制备

4．3．5 CR和IACR的蛋白质含量及活力测定

4．3．6 界面自组装羰基还原酶制备条件优化

4．3．7 界面自组装羰基还原酶还原转化条件优化

4．3．8 界面自组装羰基还原酶与游离羰基还原酶的比较

4．4 结果与讨论

4．4．1 界面自组装羰基还原酶的最优制备条件测定

4．4．2 界面自组装羰基还原酶还原转化的最优条件测定

4．4．3 界面自组装羰基还原酶与游离羰基还原酶的比较

本章小结

第五章 界面自组装羰基还原酶的催化反应机理和动力学

5．1 引言

5．2 动力学模型的建立

5．2．1 反应机理

5．2．2 模型推导

5．3 实验材料

5．3．1 菌种

5．3．3 试剂与仪器

5．4 实验方法

5．4．1 菌体培养及界面自组装羰基还原酶制备

5．4．2 界面自组装酶的生物还原反应

5．4．4 分析方法

5．5 结果与讨论

5．5．1 还原反应中生物细胞内辅酶含量

5．5．2 反应动力学模型的应用

5．5．3 底物浓度和反应速度随时间变化的情况

5．5．4 反应速度随NADH浓度和底物浓度的变化情况

本章小结

总结与展望

参考文献

硕士期间发表的论文和专利