氡温泉耐辐射嗜热微生物的分类鉴定及其耐辐射机制的初步研究

摘要

极端微生物因其独特的生理学特征和巨大的工业潜在价值，已成为微生物新资源开发的热点。耐辐射嗜热菌属双极微生物范畴，由于其独特的耐辐射和嗜热双重特性，在农业、环境、生物医学、甚至国防等领域展现出巨大的应用前景。本文利用PCR-DGGE技术研究了氡温泉微生物的群落结构，并通过传统的培养方法结合分子分类学对耐辐射嗜热微生物进行了分类鉴定，同时对一株耐辐射嗜热菌的特性及其耐辐射机制进行了初步的研究。
　　 论文对不同方式富集的氡温泉水样品中基因组DNA的提取方法进行了探索，发现传统的CTAB法比较适合样品中基因组DNA的提取。对细菌16SrDNAV3区PCR扩增的引物和反应程序进行优化，结果表明：(1)带有“GC发夹”结构的PCR产物在DGGE分析时能得到较好的分离效果，而不带有“GC发夹”的PCR产物在DGGE胶中由于具有相似的电泳行为不能被分离；(2)降落PCR与普通PCR相比，前者的PCR产物在数量和特异性方面都较后者好。利用DGGE垂直胶确定了细菌DGGE水平电泳的最佳变性梯度为35％～60％。
　　 对不同方式富集（共11个样品）的PCR产物进行DGGE水平电泳分析，发现样品在DGGE的中分散度很好，DGGE指纹图谱中有12个明显的主要条带，对其进行回收，并通过序列分析建立文库。再将获得的16SrDNA序列登陆NCBI与已知序列进行比对，得到了整个氡温泉水样中的群落结构信息，其中11株细菌归为5个不同的属，分别是Anoxybacillus,Geobacillus,Ureibacillus,Brevibacillus和Aneurinibacillus；另1株细菌与尚未获得培养的细菌的16S rDNA同源性很高，很可能是无法归类的新菌种。同时对不同剂量辐照处理前后的样品进行了DGGE指纹图谱分析，结果表明只有代表Brevibacillus和Aneurinibacillus的条带消失，说明整个氡温泉群落结构主要由耐辐射嗜热菌属构成。
　　 氡温泉水样采用8kGy剂量60Coγ-射线辐射预处理后，在55℃的温度下进行培养并分离得到35株耐辐射嗜热菌。运用细菌全蛋白电泳SDS-PAGE比较分析和16S-23S rDNA间隔区比较分析等分子生物学方法从中筛选得到8株种属不同的耐辐射嗜热菌，并进一步运用16S rDNA序列分析鉴定其种属关系。对已测序列和GenBank中已登录的16S rDNA序列进行核苷酸同源性比较，菌株S1，S9和T9的序列分别与Anoxybacillus gonensis NCIMB13933T(AY122325)，Ureibacillus thermosphaericus DSM10633T(AB210995)和Geobacillustoebii SK-1T(AF326278)的同源性都到达到99％以上。结合形态学、生理生化特征、脂肪酸成分、(G+C)mol％含量以及16S rDNA序列分析，菌株S1，S9和T9可能分别是Anoxybacillus，Ureibacillus和Geobacillus的一个新种。
　　 为了进一步研究耐辐射嗜热菌株的性质，考察了菌株T9的特性并对其耐辐射的机制进行了初步的探讨。结果表明，菌株T9对UV和γ-射线辐射具有较高耐受性，同时对DNA损伤试剂H2O2和丝裂霉素C也表现出极高的抗性，这可能与其有独特的DNA修复系统有关。有研究报道，在逆境胁迫下，可以诱导生物体内产生NO，认为NO是逆境胁迫诱导生物体内发生一系列反应的重要信号分子之一。本文的研究结果表明，在菌株T9受到UV辐照的过程中，同时诱发了NO的迸发，暗示NO可能是辐照胁迫诱导菌株耐辐射的信号分子。本文研究发现，NO淬灭剂cPTIO能够有效地抑制辐照胁迫诱导的菌株耐辐射，同时外源NO供体SNP能够有效地提高菌株耐辐射的能力。可知，NO确实参与介导辐照胁迫诱导的菌株耐辐射，可能是此过程中的关键信号分子，这对于揭示菌株耐辐射的机制提供了重要的依据。菌株耐辐射机制的另一个方面是菌株在长期进化过程中形成的抗氧化防御体系。本文研究表明，NO淬灭剂cPTIO能够有效地降低菌株抗氧化的能力，而外源NO供体SNP能够很好地保护菌株抗氧化，抵抗外界的氧化压力。可见，NO也可能是菌株抗氧化防御体系中的信号分子。但是，具体的信号调控过程还有待进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

第1章 前言

1.1 极端环境下的微生物

1.2 嗜热菌研究

1.2.1 嗜热菌的分类

1.2.2 嗜热菌的生态环境

1.2.3 嗜热菌的多样性

1.2.4 嗜热菌的生存机理

1.2.5 嗜热菌的应用价值

1.3 耐辐射嗜热微生物的研究

1.3.1 耐辐射微生物的起源进化

1.3.2 耐辐射嗜热菌的分布及多样性

1.3.3 耐辐射菌的耐辐射机理

1.3.4 耐辐射嗜热菌的应用及前景

1.4 微生物的分类与鉴定

1.4.1 蛋白质分析

1.4.2 DNA碱基比例的测定

1.4.3 rRNA序列分析

1.4.4 DNA-DNA分子杂交

1.4.5 DNA指纹法

1.5 变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术

1.5.1 PCR-DGGE技术基本原理

1.5.2 PCR-DGGE技术的应用工作流程

1.5.3 PCR-DGGE技术在微生物多样性研究中的应用

1.5.4 PCR-DGGE技术的优缺点

1.6 本文研究目的和内容

1.6.1 研究目的

1.6.2 研究内容

第2章 PCR-DGGE技术对氡温泉中细菌多样性的研究

2.1 实验材料

2.1.1 取样点描述及样品采集

2.1.2 药品及试剂

2.1.3 主要培养基

2.1.4 试剂盒

2.1.5 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 氡温泉中细菌样品的培养及菌体收集

2.2.2 氡温泉中细菌样品的辐照处理及菌体富集

2.2.3 菌体基因组总DNA抽提

2.2.4 16S rDNA V3区的PCR扩增

2.2.5 16S rDNA V3区样品的DGGE分析

2.2 结果与分析

2.2.1 基因组DNA的提取及纯化

2.2.2 PCR反应程序的探索与优化

2.2.3 “GC发夹”结构对DGGE分离效果的影响

2.2.4 最佳变性剂浓度梯度的确定

2.2.5 氡温泉中细菌群落的DGGE指纹图谱分析

2.2.6 辐照处理前后细菌群落的DGGE指纹图谱分析

2.2.7 16S rDNA文库构建及同源性分析

2.3 本章小结

第3章 氡温泉中耐辐射嗜热菌的分离、筛选及鉴定

3.1 实验材料

3.1.1 样品

3.1.2 菌株

3.1.3 试剂盒

3.1.4 工具酶

3.1.5 主要试剂

3.1.6 主要仪器

3.1.7 寡核苷酸

3.1.8 分析软件

3.1.9 培养基及主要溶液

3.2 实验方法

3.2.1 耐辐射嗜热菌的培养与分离

3.2.2 耐辐射嗜热菌的筛选

3.2.3 耐辐射嗜热菌的鉴定

3.3 结果与分析

3.3.1 耐辐射嗜热菌的分离与筛选

3.3.2 耐辐射嗜热菌的初步鉴定

3.3.3 耐辐射嗜热菌S1的鉴定

3.3.4 耐辐射嗜热菌S9的鉴定

3.3.5 耐辐射嗜热菌T9的鉴定

3.3.6 讨论

3.4 小结

第4章 菌株T9耐辐射特性及其耐辐射机理的初步研究

4.1 实验材料

4.1.1 菌株及保藏

4.1.2 药品及试剂

4.1.3 主要培养基及溶液

4.1.4 主要仪器

4.2 实验方法

4.2.1 菌种的活化培养

4.2.2 菌株T9UV和γ-射线辐射抗

4.2.3 菌株T9对H2O2和丝裂霉素C的抗性检测

4.2.4 NO含量的测定

4.2.5 UV胁迫处理菌液后NO含量的测定

4.2.6 cPTIO的添加和SNP的添加对菌株T9耐辐射性能的影响

4.2.7 cPTIO的添加和SNP的添加对菌株T9抗氧化性能的影响

4.3 结果与分析

4.3.1 菌株T9耐UV和60Coγ-射线辐射特性

4.3.2 菌株T9对H2O2和丝裂霉素C的抗性特性

4.3.3 UV辐照处理菌株T9诱发细胞NO迸发

4.3.4 NO介导菌株T9耐辐射

4.3.5 NO介导菌株T9抗氧化

4.3 小结

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

附录 攻读硕士期间发表的学术论文

致谢