应用转基因技术提高稻谷耐贮藏特性的研究

摘要

该研究利用基因工程新近研究进展,分别采用反义RNA及RNA干涉技术在水稻胚乳中特异沉默内源lox基因,以期提高稻谷自身的耐贮藏遗传特性.另外,基于对转基因安全的考虑,特别是该试验的目的器官是作为粮食的水稻胚乳,作者从Syngenta公司引进了甘露糖选择标记基因,以期能初步建立水稻遗传转化的甘露糖选择标记系统,为今后能在水稻转基因研究中利用这一安全的选择标记系统打下基础.主要研究结果如下:1)构建了三个用于转化的双元表达载体:A:p13W4H,含胚乳特异表达启动子、lox cDNA发夹结构及潮霉素选择标记基因hpt;B:p13W8AP,含胚乳特异表达启动子、lox cDNA反义结构及甘露糖选择标记基因manA;C:p13W8HP,含胚乳特异表达启动子、lox cDNA发夹结构及甘露糖选择标记基因manA.2)以农杆菌介导用表达载体p13W4H对粳稻品种石狩白毛(Ishikari-shiroge)和T162进行了转化,分别获得158个和56个独立转化株系.经PCR检测,石狩白毛转基因植株的PCR阳性率为94.3﹪(149/158),T162转基因植株的PCR阳性率为98.2﹪(55/56).Southern检测结果表明,外源DNA片段已完整整合到水稻基因组中,多数为单拷贝插入,拷贝数最多的有4个.对部分T1代种子进行了潮霉素抗性遗传分析,证明外源基因在转基因后代中发生了分离.3)以幼胚为转化受体,农杆菌介导分别用p13W8AP和p13W8HP对粳稻品种石狩白毛进行了转化,经过在含不同甘露糖和蔗糖浓度组合的培养基上筛选,分别获得13个和27个独立转化株系.该研究初步建立了水稻遗传转化的甘露糖选择标记系统.文中还对该体系的各种影响因素及存在的问题分别进行了分析讨论.4)分别对转p13W4H的9个、转p13W8AP的2个和转p13W8HP的4个株系的T1代种子进行了人工陈化以及LOX酶活测定,并将它们分别与潮霉素或甘露糖抗性遗传分析结果以及Southern杂交结果进行了对比.文中还对lox cDNA不同结构及其拷贝数对水稻内源基因的沉默或阻抑效果以及可能的机制进行了讨论.

目录

致谢

第一篇文献综述

第一章植物脂氧合酶研究进展

1.脂氧合酶简介

2.脂氧合酶在植物中的分布

3.脂氧合酶途径

4.脂氧合酶的测定方法

5.脂氧合酶的生化特性

6.脂氧合酶的生理学功能

7.脂氧合酶基因及其表达

8.脂氧合酶与稻谷耐贮特性

第二章RNA干涉(RNAi)研究进展

1.RNAi的发现

2.RNAi的特征

3.RNAi的可能分子机制

4.与RNAi相关基因的克隆

5.RNAi的生理功能

6.RNAi应用前景

第三章植物遗传转化的选择标记

1.负向选择标记系统

2.正向选择标记系统

3.消除选择标记基因

第四章本研究的背景、意义及研究内容

1.研究背景和意义

2.主要研究内容

第二篇研究报告

第一章用于转化的表达载体的构建

1.材料与方法

2.结果与分析

3.讨论

第二章根癌农杆菌介导p13W4H转化水稻

1.材料与方法

2.结果与分析

3.讨论

第三章甘露糖选择标记系统的初步建立

1.材料与方法

2.结果与分析

3.讨论

第四章转基因水稻的耐贮藏特性研究

1.材料与方法

2.结果与分析

3.讨论

第五章结论及进一步研究设想

1.结论

2.进一步研究设想

参考文献

附录A主要化学试剂、分子生物学试剂及仪器

附录B主要培养基、缓冲液配方及配制方法

附录C本文所用缩略词表