中国人遗传性非息肉病性结直肠癌家系收集、整理及分子遗传学和临床病理特征分析

摘要

大肠癌中约25％有遗传背景。其中家族性腺瘤性息肉病(FAP)占1％，遗传性非息肉性大肠癌占5％～10％。其余则为散发性、炎性肠病(溃疡性结肠炎和克隆病)等。遗传性非息肉病性结直肠癌是一种常染色体显性遗传病，错配修复基因失活所致细胞错配修复功能的丧失或缺陷，引起微卫星不稳定性的发生，是遗传性非息肉病性结直肠癌的主要发病机制。 目前已克隆出的错配修复基因，包括：hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPSM1、hPSM2、hMSH3、hMSH5、hMLH3和EXO1等。其中hMSH2与hMLH1的突变在遗传性非息肉病性结直肠癌中起主要作用，两者的突变占所有错配修复基因突变检出的80％～90％以上，因此，hMSH2与hMLH1基因的突变是目前研究热点。 如何应用一种有效的筛查检测基因突变方法仍在探索中。随着遗传性非息肉病性结直肠癌家系遗传学方面的研究，针对现有个体的研究已不能满足有关遗传学方面的深入研究。长期研究需要将家系成员的遗传物质保留和存储，以便在今后相当长时间使研究能够继续下去。因此，提出建立遗传性非息肉病性结直肠癌家系永生化细胞株的概念。应用新型免疫抑制剂环孢素A来建立EB病毒转化的外周血淋巴母细胞，是方法学上的一大突破。 从分子遗传表型和临床表型来看，东西方国家由于存在地域、民族等差异，表现出遗传性非息肉病性结直肠癌在分子遗传表型和临床表型不同，目前，遗传性非息肉病性结直肠癌的诊断在国际上普遍采用Amsterdam诊断标准，但是由于该标准在临床使用过程中暴露出一些不足，各国纷纷提出了一些新的标准，如韩国人提出的可疑遗传性非息肉病性结直肠诊断标准、瑞典人提出瑞典人遗传性非息肉病性结直肠癌诊断标准等。结合我国实际国情，全国遗传性大肠癌协作组针对中国人肿瘤发病特点提出了中国人遗传性非息肉病性结直肠癌诊断标准，以便能正确了解中国人遗传性非息肉病性结直肠癌的分子遗传学和临床特征。本研究收集、整理符合中国人遗传性非息肉病性结直肠癌标准的31个家系，针对收集整理的31个中国人遗传性非息肉病性结直肠癌家系临床病理特点予以分析，评价中国人遗传性非息肉病性结直肠癌诊断标准的临床应用价值。分析中国人遗传性非息肉病性结直肠癌家系错配修复基因hMLH1、hMSH2遗传突变的特点，同时建立家系永生化细胞株。 第一部分中国人遗传性非息肉病性结直癌家系临床病理特征分析 目的：分析评价中国人遗传性非息肉病性结直肠癌家系的临床病理特点。 方法：收集整理符合中国人遗传性非息肉病性结直肠癌诊断标准家系31个家系，记录的数据包括患者性别、结直肠癌发生的部位、诊断年龄、是否有多原发性结直肠癌及结肠外肿瘤特点、临床分期、大体类型、组织分化程度、癌细胞黏液成分、有无肿瘤坏死等。按照Amsterdam诊断标准(含标准Ⅰ、Ⅱ)、日本标准、可疑HNPCC标准、Bethesda指导纲要、中国人HNPCC标准分为AC组、JC组、sHNPCC组、BG组、CHNPCC组，另收集同期散发性结直肠癌35例作为对照，不同标准间进行临床病理特点比较。 结果：31个家系共发生136例次恶性肿瘤(多原发肿瘤14例)，其中结直肠癌患者106例次，占所有肿瘤患者的77.9％，诊断年龄均数48.6±29.0岁；胃癌14例，占所有肿瘤患者的10.3％；左半结肠癌和直肠癌占所有结肠癌的52.8％(56/106)；107个肿瘤患者中男性69个，女性38个，男女比例1.6：1，先证者诊断年龄均数44.8±9.7岁。符合AC者(含ACⅠ和ACⅡ)13个，符合JC者19个，符合sHNPCC者18个，符合BG者31个，患第一癌平均年龄5组不同标准的患者分别与SCRC组相比较差异有显著性(P＜0.01)。第一癌发病年龄小于50岁患者的比例前5组明显高于SCRC组(P＜0.05)，前5组间比较差异无显著性。 Duke's分期中，AC组、JC组、sHNPCC组、BG组、CHNPCC组属于A/B期例数明显多于SCRC组，前5组A/B期例数和C/D期例数与SCRC组比较差异有显著性(P＜0.05)。Crohn's病样淋巴反应显著者AC组、BG组、CHNPCC组明显高于SCRC组(P＜0.01)。AC组、sHNPCC组、BG组、CHNPCC组外生性生长的比例高于SCRC组，AC组、BG组、CHNPCC组外生性生长和非外生性生长比例与SCRC组比较有差异显著性P＜0.01)，sHNPCC组与SCRC组比较有差异显著性P＜0.05)。肿瘤分化程度高中分化与低分化相比较，AC组、sHNPCC组、BG组、CHNPCC组与SCRC组有差异显著性(P＜0.01)。肠外相关性恶性肿瘤共30例，占所有肿瘤患者的22.1％(30/136)，男女性别比1.8：1，其中胃癌14例，占肠外相关性恶性肿瘤的46.3％(14/30)，多原发结直肠癌9例，结直肠癌并发肠外恶性肿瘤5例(其中胃癌4例，卵巢癌1例)。各组肠外肿瘤胃癌是第一位。 结论：(1)中国人遗传性非息肉病性结直肠癌家系成员结直肠癌发病年龄早于散发性大肠癌近20年。先证者发病时年龄与与西方国家报道相近。(2)中国人HNPCC家系临床特点表现与西方国家比较不同是左半结肠癌和直肠癌多见、多原发结直肠癌比率较低、肠外恶性肿瘤以胃癌最常见等。(3)中国人遗传性非息肉病性结直肠癌家系结直肠癌预后好于散发性大肠癌。 第二部分变性高效液相色谱仪检测中国人遗传性非息肉病性结直肠家系错配修复基因hMSH2、hMLH1突变 目的：建立并评价用变性高效液相色谱仪检测错配修复基因hMLH1、hMSH2基因突变的方法；分析符合中国人遗传性非息肉性结直肠癌诊断标准家系hMLH1、hMSH2基因遗传性突变特点。结合不同诊断标准，分析评价中国人遗传性非息肉性结直肠癌诊断标准。以及检测的基因突变和非突变家系成员患恶性肿瘤的临床病理特点，分析评价中国人遗传性非息肉病性结直肠癌家系的基因突变与临床表型的关系。 方法：取31个符合中国人遗传性非息肉性结直肠癌标准的遗传性非息肉性结直肠癌家系肿瘤先证者外周血DNA样品，应用聚合酶链式反应及变性高效液相色谱仪筛查hMLH1和hMSH2基因的突变，然后对变性高效液相色谱仪图形异常的样本进行测序。以Amsterdam标准、Japanese标准、Bethesda指导、Chinese标准分为4组，观察每组基因突变情况。以及检测的基因突变和非突变家系成员患恶性肿瘤的临床病理特点。 结果：31个符合中国人遗传性非息肉性结直肠癌标准的家系肿瘤先证者中共检出分属于17个不同家系的23个碱基变异位点，经DNA序列分析，共证实外显子突变10个(10/31，32.9％)，其中3个为同义突变未引起蛋白质序列的改变，另外7个为病理性改变，分别为3个错义突变、2个无义突变、2个移码突变。10个突变中7个突变位点(其中病理性突变4个)均为首次报道。另在外显子区还检测到5个已知SNP，内含子区检测到8个碱基改变，其中5个为已知SNP，3个意义尚不明确。两个家系成员有突变，其中一个家系成员中5个成员存在相同突变，其中一个确诊结肠癌，4个携带者。另一个家系成员中3个携带。31个家系在不同标准预示突变敏感方面，符合Japanese标准组发现突变占89.5％。Bethesda指导组和Chinese标准组其次，均为74.2％。Amsterdam标准组发现突变占比例最低，为61.5％。经过统计学分析不同标准预示突变率差异无显著性(P＞0.05)。基因突变与临床表型结果分析差异无显著性(P＞0.05)。 结论：(1)变性高效液相色谱仪检测hMLH1、hMSH2基因杂合性突变高效、简便、重复性好。(2)符合中国人遗传性非息肉性结直肠癌标准家系约有1/3可检出hMLH1、hMSH2基因遗传性种系突变，其中错义突变、同义突变较多见。(3)中国人遗传性非息肉性结直肠癌家系标准即能体现遗传性非息肉性结直肠癌家系普遍的临床特征，也能反映出中国人群及肿瘤瘤谱的一些特征。 第三部分中国人遗传性非息肉病性结直肠癌家系的收集整理和永生化细胞系的建立 目的：收集、整理符合中国人遗传性非息肉病性结直肠癌诊断标准的31个家系成员，尽最大可能提取外周血，建立永生化细胞系。 方法：按照中国人遗传性非息肉病性结直肠癌诊断标准，收集、整理31个家系，其中27例为浙江省内，4例为其他省市。31个家系共有成员329例，签署知情同意书并提取外周血者251例，EDTA抗凝管共收集外周血5-8ml低温保存，应用淋巴细胞分离液提取淋巴细胞，EB病毒转化同时加入环孢素A制成永生化细胞株，观察建株成功率。 结果：成功提取外周血者占所有家系成员的76.3％，转化成功218个样品，转化成功率为93.2％，建株成功208个样品，建株成功率82.9％，建株的平均时间是18天。 结论：首次建立中国人遗传性非息肉病性结直肠癌家系永生化细胞株，对人类遗传学研究有着极大实用价值。免疫抑制剂环孢素A应用于建立永生化细胞株，提高了建株成功率。

目录

英文缩略语表

本课题创新点

第一部分 中国人遗传性非息肉病性结直肠癌家系临床病理特征分析

第二部分 变性高效液相色谱仪检测中国人遗传性非息肉病性结直肠癌家系错配修复基因hMSH2、hMLH1突变

第三部分 中国人遗传性非息肉病性结直肠癌家系的收集整理和永生化细胞系的建立

综述： 遗传性非息肉病性结直肠癌的诊断和治疗进展

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