兼性胞内寄生菌HLK1对人宿主细胞的感染和持续性寄生的研究

摘要

目前，病原菌仍是人类健康最大的威胁之一，比如急性呼吸道感染、腹泻、肺结核等疾病都是由于病原菌的感染所致。而且，新的细菌感染性疾病的不断出现，以及大量致病菌的反复出现和耐药性的增加，对公众健康造成可怕的威胁。因此，对潜在病原菌的发现以及病原菌致病机理的研究一直是研究的热点之一。 人红白血病细胞系K562细胞被广泛用于实验室的研究。当我们对K562细胞进行核型分析过程中，意外地发现K562细胞染色标本中有杆状细菌样的结构。为了排除该实验中相关实验试剂的环境细菌污染，我们严格控制了各种实验试剂和实验操作。然而，多次重复实验仍得到以上结果。因此，我们推论该细胞中可能存在一种细胞内生菌。由于该菌可能是一种新的胞内寄生菌，就有必要明确该菌在细菌分类中的地位，以及该菌的基本的生物学特性。 第一部分：HLK1T的分离和鉴定 目的：对细菌的分类鉴定是了解其生物学功能和特性的基础。为明确HLK1T的分类地位及其基本生物学特性，该研究从人红白血病细胞系562细胞中分离获得HLK1T菌株并对其进行了系统鉴定。 方法：K562细胞涂哥伦比亚琼脂基础血平板(5％绵羊血)，分离获得HLK1T菌株，用透射和扫描电镜观察HLK1T的形态特征，API-20E试条进行生理生化特性鉴定，用ATB药敏试条检测HLK1T的药敏，HPLC法分析HLK1T菌株的全基因组DNA的(G+C)mol％，克隆并测序16SrRNA和gyrB基因，用MEGA2软件对HLK1T进行系统分类。 结果：HLK1T为革兰氏阴性杆菌，长0.5-2μm，宽0.3-0.5μm，无孢子形成，能运动，极性单鞭毛。无发酵能力，需氧，氧化酶和过氧化氢酶阳性。基因组(G+C)mol％含量为71.2±0.2mol％。16SrRNA序列与Phenylobacterium属的P.lituiformeFail3菌株的16SrRNA序列同源性为98％，gyrB基因序列的同源性为89％。 结论：成功地从人红白血病K562细胞中分离获得HLK1T菌株；HLK1T为α-Proteobacteria纲Phenylobacterium属的一个新菌种，命名为Phenylobacteriumzucineum.sp.nov.HLK1T。从HLK1T的人宿主细胞来源以及α-Proteobacteria细菌属性显示，HLK1T与人类存在某种密切的关系。 第二部分：HLK1T对人宿主细胞的侵袭和建立胞内寄生的研究 目的：胞内寄生菌对宿主细胞的侵袭方式主要有“拉链式”和“触发式”两种，并能主动劫持宿主细胞的功能建立胞内寄生环境。本研究探讨了PhenylobacteriumzucineumHLK1T对不同来源的人宿主细胞SW48O、L02和Jurkat细胞的侵袭和胞内寄生的机理。 方法：扫描和透射电子显微镜检测HLK1T侵袭宿主细胞的方式，以及胞内寄生方式；激光共聚焦显微镜检测细胞骨架蛋白对HLK1T侵袭和胞内运动能力的影响；细胞免疫化学和CFU计数检测HLK1T侵入SW480和Jurkat细胞的时间和浓度关系；HLK1T基因组测序由北京华大基因研究中心完成；HLK1T基因组的生物信息学分析，检测HLK1T兼性胞内寄生相关的毒力因子。 结果：HLK1T菌能紧密粘附于SW480、L02、Jurkat细胞表面，并形成吞噬体侵入胞内。热灭活的HLK1T失去侵袭宿主细胞的能力。细胞骨架抑制剂和激光共聚焦实验显示，HLK1T对宿主细胞的侵袭依赖于细胞骨架蛋白F-actin和微管蛋白的聚合。 结论：HLK1T为人宿主细胞兼性胞内寄生菌，能通过“拉链”方式侵袭多种来源的人宿主细胞。HLK1T对宿主细胞的侵袭过程依赖于HLK1T的代谢活性，以及宿主细胞骨架的参与和重排。HLK1T能在2小时内完成对宿主细胞的侵袭并突破吞噬体膜进入胞浆的过程。侵入胞内的HLK1T集中定居在细胞核周围网膜结构丰富的区域，并能扩散和感染邻近宿主细胞。HLK1T含有大量编码细菌粘附宿主细胞表面的粘附因子，以及裂解吞噬体膜进入胞质生长繁殖的脂/酯酶，和建立胞内寄生相关的VirB/VirD4分泌系统。该研究证明了HLK1T的胞内寄生能力，为研究细菌与人宿主细胞的关系提供了新的研究材料。该胞内寄生特性显示，HLK1T具有潜在的逃避人宿主免疫并导致致病的能力。 第三部分：HLK1T对人宿主细胞的毒性作用及持续性感染能力的研究目的：胞内寄生病原菌都具备胞内生长繁殖并造成细胞或组织损伤而致病的能力。有些胞内寄生菌还能转变成细菌L型并建立对宿主的长期持续性的感染和寄生。为明确HLK1T的致病能力，该研究探讨了兼性胞内寄生菌HLK1T对人宿主细胞SW480细胞的毒性作用，以及HLK1T对SW480和Jurkat细胞长期性寄生的能力和方式。 方法：流式细胞仪(FCM)计数检测细胞生长能力；FCM检测细胞周期；DNA电泳分析DNA-ladder；透射电镜检测SW480细胞的死亡方式和胞内细菌的形态；CFU计数检测HLK1T菌在SW480细胞和Jurkat细胞内的增殖能力，以及长期性寄生能力。 结果：在有大量胞外HLK1T存在的情况下，HLK1T能显著抑制SW480和Jukart细胞的生长，抑制能力存在浓度和时间依赖性。当HLK1T以MOI为500的浓度处理SW480和Jurkat细胞72小时后，SW480和Jukart细胞仍保持一定的生长增殖能力，与处理前比较分别增殖了(63.75±16.25)％和(93.75±11.84)％。HLK1T以MOI为500的浓度处理SW480细胞72小时后，能引起SW480细胞周期S期阻滞，并引起细胞的凋亡和坏死，其细胞死亡率为(7.94±2.60)％。获得HLK1T长期性感染的SW480和Jurkat细胞，其生长能力和细胞周期与对照无显著差异。HLK1T能以不典型细菌与典型细菌两种形态长期存在细胞胞质内并与宿主细胞保持恒定的比例关系。在获得长期性感染的Jurkat和SW480细胞内，不典型细菌的含量分别为：(91.76±5.08)％和(68.8±9.37)％。 结论：在有大量胞外HLK1T存在的情况下，HLK1T对宿主细胞有一定的毒性作用，能引起宿主细胞的坏死和凋亡，但宿主细胞的死亡率较低；HLK1T能以适当比例的L型和完整型两种细菌形式长期性寄生在人宿主细胞内；长期性感染的HLK1T不影响宿主细胞的生长能力和细胞活力。同时，胞内寄生菌HLK1T的长期性寄生能力，以及含有α-Proteobacteria菌胞内长期性寄生相关的VirB/VirD4四型分泌系统的结果显示，HLK1T具有潜在的长期性感染和致病的能力。 第四部分：HLK1T对人宿主细胞持续性感染的机理研究目的：为建立胞内寄生环境，胞内寄生菌具有劫持宿主细胞的功能并控制细胞的生长和死亡的能力。同样，胞内寄生菌也能调控自身的生长繁殖以建立长期性胞内寄生。为探讨兼性胞内寄生菌HLK1T调控自身生长繁殖以建立长期性寄生的机理，该研究从HLK1T中克隆获得与C.crescentus中的ctrA基因高度同源的ctrZ基因。在C.crescentus中，CtrA蛋白作为主调控子调控多种细胞周期事件，比如DNA甲基化，DNA复制，鞭毛和纤毛的形成以及细胞分裂。同时，在细胞周期过程中，CtrA的含量和磷酸化活性形式均受到严格的控制。当CtrA在细胞内持续高表达后，C.crescentus的染色体无法起始复制，细菌停滞在G0期。因此，对CtrZ功能的研究能为阐明HLK1T持续性感染人宿主细胞的机理提供理论基础。 方法：CLUSTALW进行氨基酸序列同源分析；SWISS-MODEL预测CtrZ和CtrA蛋白的三级结构；PCR克隆ctrZ基因；常规的分子生物学方法构建pSAL-ctrZ和pSAL-pro-ctrZ表达质粒；通过细菌接合实验将pSAL14、pSAL-ctrZ和pSAL-pro-ctrZ质粒转移到ctrA功能缺失的温度敏感菌LS2195；透射电镜和Gimsa染色检测获得各种表达质粒的LS2195细菌形态。 结果：CtrA和CtrZ具有94％的同源性，功能相关的保守氨基酸残基完全一致，蛋白的三级结构和功能域高度相似；ctrZ的启动子与ctrA基因的启动子区基因表达调控相关的保守序列，以及保守序列间的间隔完全一致；在HLK1T中，与CtrA功能相关的CcrM，DivK和ClpX蛋白也显示高度同源性；成功的将表达质粒pSALl14、pSAL-ctrZ和pSAL-pro-ctrZ分别转移至LS2195温度敏感菌株中。获得表达质粒pSALl14、pSAL-ctrZ或pSAL-pro-ctrZ的LS2195温度敏感株能回复野生型C.crescentusNA1000的形态和性状。 结论：CtrZ与CtrA具有94％的同源性，同属转录调控子OmpR家族；CtrZ能完全替换主调控子CtrA在C.crescentus中的功能，回复温度敏感菌株LS2195至野生型性状；ctrZ和ctrA基因的启动子对基因转录的调节作用和机理一致。CtrZ与主调控子CtrA的高度同源性，以及功能和调控机理的高度一致性。这些结果提示，CtrZ在调控HLK1T的生长分裂过程中发挥重要的作用，为调控自身的生长繁殖以建立长期性胞内寄生提供基础。

目录

前言

参考文献：

第一部分：HLK1T的分离和鉴定

第二部分：HLK1T对人宿主细胞的侵袭和建立胞内寄生的研究

前言：

材料与方法

结果

讨论

结论：

参考文献：

第三部分：HLK1T对人宿主细胞的毒性及持续性感染的研究

第四部分：HLK1T对人宿主细胞持续性感染的机理研究

综述胞内寄生菌对宿主细胞侵袭和寄生的机制

附件Ⅰ

附件Ⅱ

主要试剂的配制：

在读期间发表的论文：

致谢