高分子电解质分离碱性蛋白的方法及碱性多肽SDS-PAGE条件的优化

摘要

等电点沉淀(isoelectric precipitmion)和聚合高分子电解质沉淀(polyelectrolyteprecipitation)是蛋白质分离纯化的基本技术和常用方法，用于蛋白质分离纯化的前期处理，具有设备简单，处理量大，廉价和蛋白质不变性等特点。本试验研究了聚丙烯酸(Polyacrylic Acid，PAA)分离纯化苦瓜种仁碱性蛋白和蜜蜂毒素碱性多肽的方法及其影响因素。同时，研究了丙酮对苦瓜种仁和蜜蜂毒素脂类物质的清除作用，以及碱性多肽的SDS-PAGE分离和分析方法。 丙酮与苦瓜种仁或蜜蜂毒素研磨匀浆，过滤并用丙酮洗涤，室温干燥形成蛋白．丙酮粉，与水抽提法比较，蛋白-丙酮粉的水溶性高、脂类含量少，利于蛋白质的进一步分离纯化。 等电点沉淀试验表明，在pH7.0～3.0范围内，苦瓜种仁的中、酸性蛋白沉淀析出，上清液中等电点pI值大于8.65的碱性蛋白种类和含量与粗提液相似，而等电点pI值为8.65的碱性蛋白含量随溶液pH值的降低而减少。等电点沉淀与酸介质密切相关。以柠檬酸(citric acid)调节苦瓜种仁粗提液的酸碱度，在pH7.0～6.0之间的等电点沉淀作用明显，其中pH6.0时14.62％的苦瓜种仁蛋白被沉淀；以盐酸(hydrochloric acid)调节粗提液酸碱度，在pH7.0～4.0之间的等电点沉淀作用明显，其中pH4.0时32.49％的苦瓜种仁蛋白被沉淀。醋酸(acetic acid)的等电点沉淀作用呈现阶段性特点，在pH7.0～6.0和pH5.0～4.0之间的等电点沉淀作用明显，其中pH6.0和4.0时分别有26.17％和38.72％的苦瓜种仁蛋白被沉淀。 PAA选择性沉淀苦瓜种仁碱性蛋白，与酸介质、PAA浓度和pH值的密切相关。醋酸、盐酸和柠檬酸处理的1mL苦瓜种仁粗提液，PAA(1％)选择性沉淀碱性蛋白(等电点pI为8.65～9.30)的最佳用量分别为100μl、120μl和100μl。SDS-PAGE结果表明PAA沉淀醋酸处理的苦瓜种仁粗提液碱性蛋白的效率高于沉淀盐酸和柠檬酸处理的苦瓜种仁粗提液的碱性蛋白的效率。以醋酸分别调节苦瓜种仁粗提液pH至5．0、4.0和3，0，等电点沉淀后的上清液用PAA沉淀碱性蛋白，当PAA用量为160μl/mL提取液时，pH5.0和3.0样液分别有33.77％和43.56％蛋白质被沉淀；当在PAA用量为120μl/mL提取液时，pH 4.0样液中30.83％蛋白质被沉淀。PAA-蛋白质复合物溶解于碱性溶液(pH>9.0)，溶解性与NaCl浓度的有关，当溶液NaCl浓度为3.0％时，溶液蛋白质浓度最高。 PAA选择性沉淀的苦瓜种仁碱性蛋白经Sephadex G-75柱层析分离，分别在175min和300min出现2个主峰Ⅰ和Ⅱ。SDS-PAGE和IEF分析表明主峰Ⅰ的分子量约为30kDa，pI值约为9.3，主峰Ⅱ的分子量约为10kDa，pI值约为9.5。丙酮处理形成蜂毒．丙酮粉水溶液，PAA选择性沉淀的碱性多肽经Sephadex G-25凝胶层析分离，形成二个独立吸收峰Ⅰ和峰Ⅱ，SDS-PAGE显示其分子量分别约为2800Da和1000Da，IEF显示峰Ⅰ含有等电点pI为9.0的碱性多肽。 高交联度(C≥6.0％)的尿素/SDS-PAGE是多肽分离纯化和分析检测的主要技术，因碱性多肽的分子量和电荷特性，常用酸性电泳分离纯化和分析检测。本试验初步研究了低交联度的SDS-PAGE分析蜂毒碱性多肽的方法及有关条件的优化。 SDS-PAGE结果表明，凝胶交联度C为0.67％时，样品和Marker中低分子成份堆积在凝胶前沿，不能分离；凝胶交联度为1.20％时，样品中的低分子量成分不能分离；。Marker 中低分子量多肽(分子量≤16950Da)基本分离；凝胶交联度C为1.55％时，样品和Marker中的低分子量成分分离良好；凝胶交联度C为2.00％时，样品和Marker中低分子量多肽不能分离；当凝胶交联度≥3.00％时，样品和Marker中低分子量多肽分离不理想。

目录

摘要

第一部分文献综述

第一章聚合高分子电解质分离纯化蛋白质

1聚合高分子电解质的种类

2聚合高分子电解质沉淀蛋白质的作用机理

3聚合高分子电解质沉淀蛋白质的影响因素

4聚合高分子电解质在蛋白质分离中应用及主要设备

第二章碱性蛋白的生物学

1组蛋白

2鱼精蛋白

3细胞色素C(cytochrome C)

4动物毒素碱性蛋白和碱性多肽

5蝎毒(scorpion venom)

主要参考文献

第二部分研究内容

第一章聚丙烯酸分离纯化苦瓜种仁碱性蛋白

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

主要参考文献

第二章聚丙烯酸分离纯化蜜蜂毒素碱性多肽

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

主要参考文献

第三章碱性多肽SDS-PAGE方法的改良

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

主要参考文献

第三部分结 论

硕士学习期间的成果和荣誉

致谢