sflk1-IFN-γ融合蛋白基因重组质粒的构建、表达及生物学活性鉴定

摘要

恶性肿瘤的生长、浸润和转移必须依靠肿瘤新生血管提供足够的营养，因此抑制或破坏肿瘤血管生成已成为近年来肿瘤治疗的新方法。血管内皮生长因子(VEGF)与表达在血管内皮细胞上的相应受体VEGFR2结合所引起的信号转导是血管生成中的限速步骤，在整个血管生成中发挥着关键作用。可溶性血管内皮生长因子受体2(sVEGFR2，在小鼠中被称为sflk1)可竞争性地结合VEGF，从而阻断VEGF与VEGFR2结合所引起的信号转导，抑制肿瘤细胞诱导的血管生成和肿瘤的生长。IFN-γ是细胞介导的免疫应答中非常重要的效应因子，能诱导CTL应答及Th1细胞的分化，并且尚能直接抑制多种肿瘤的生长，同时它自身也有抑制肿瘤血管生成的作用。因此构建了pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ重组质粒，将其在CHO细胞中高效稳定表达，并对其表达产物sflk1-IFN-γ融合蛋白的生物学活性进行了研究鉴定。 目的:构建小鼠可溶性的血管内皮生长因子受体2(sflk1)与小鼠IFN-γ(mIFN-γ)融合基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ；将该重组质粒在CHO细胞中表达，筛选出高效稳定表达sflk1-IFN-γ融合蛋白的CHO细胞株；并对该融合蛋白的生物学活性进行鉴定。 为比较sflk1-IFN-γ融合蛋白与单独的sflk1蛋白及IFN-γ蛋白的生物学功能上的差异，我们又构建了pcDNA3.1(+)/IFN-γ和pcDNA3.1(+)/sflk1，并同时在CHO细胞中表达，对三者表达产物的生物学功能进行比较分析。 方法: 1.以RT-PCR法，分别从小鼠血管内皮细胞系H5V和小鼠脾细胞特异性扩增sflk1和IFN-γ的cDNA，将sflk1与IFN-γcDNA分别插入pcDNA3.1(+)的多克隆位点中，构建成pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ真核表达质粒。同时构建pcDNA3.1(+)/IFN-γ；pcDNA3.1(+)/sflk1由本所提供。 2.将上述三个质粒及pcDNA3.1(+)空载体质粒分别转染COS-7细胞(非洲绿猴肾细胞系)作瞬时表达，ELISA检测48h转染上清中sflk1和IFN-γ蛋白表达水平，Westernblotting检测胞内sflk1-IFN-γ融合蛋白；分别以H5V增殖抑制试验和NK活性检测表达上清中sflk1-IFN-γ融合蛋白的sflk1和IFN-γ生物学活性。 3.将pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ、pcDNA3.1(+)/sflk1及pcDNA3.1(+)/IFN-γ三个质粒分别与pSV2-dhfr+载体体外共转染CHO-dhfr-细胞，以MTX抗性筛选标记基因dhfr扩增体系及有限稀释筛选高效稳定表达sflk1-IFN-γ融合蛋白、sflk1和IFN-γ的CHO细胞株。 结论: 1.成功构建了pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ与pcDNA3.1(+)/IFN-γ真核表达质粒。 2.pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ重组质粒能够在真核细胞中有效表达，且表达的sflk1-IFN-γ融合蛋白兼有sflk1和IFN-γ两者的生物学活性。 3.获得高效稳定表达sflk1-IFN-γ融合蛋白的CHO细胞株。

目录

英文缩略词表

前言

第一部分pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ重组质粒的构建及生物学活性鉴定

第二部分高效稳定表达sflk1-IFN-γ融合蛋白的CHO细胞株的筛选

讨论

结论

参考文献

白细胞介素23研究进展

学习期间参加课题与发表论文情况

致谢