大肠杆菌无细胞系统合成人β-防御素和艾滋病病毒蛋白的研究

摘要

近年来一种以外源mRNA或DNA为模板，通过在细胞抽提物的酶系中补充底物和能量物质来合成蛋白质的体外蛋白质合成系统越来越引起重视。与传统的体内系统相比，无细胞系统具有众多的优越性：1)反应简便，只需加入抽提物、DNA模板和各种必需的反应底物，就可以表达目的蛋白；2)可用于表达在体内系统中难于表达的蛋白质，如对细胞有毒害作用的抗菌肽和膜蛋白等；3)能够直接以PCR产物作为线性模板在微孔板上同时平行合成多种蛋白质，能够满足高通量药物筛选和蛋白质组学研究等的需要。 人β-防御素是近年来发现的具有广谱抗菌活性并在机体抵御外来微生物入侵中起防御作用的一类阳离子抗菌肽。有望成为解决致病菌耐药性问题的新型内源性抗生素，并被证明具有抑制艾滋病病毒复制的作用。分别对从人体炎症皮肤组织中通过RT-PCR方法克隆获得的人β-防御素-2(HBD-2)人源基因、经密码子优化后的HBD-2人工合成基因构建了HBD-2的表达载体，得到了一系列不同密码子来源或带有不同融合标签的HBD-2的体外表达载体。将不同密码子来源的HBD-2的表达载体在大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统中进行表达，对比实验结果表明，密码子优化后合成基因的蛋白质表达量与人源基因表达量相当。 进一步将带有不同融合标签(如硫氧化还原蛋白，trxA和绿色荧光蛋白，GFP)的HBD-2表达载体在大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统中进行表达研究。结果表明，融合标签的添加明显提高了HBD-2的表达量，其中trxA对HBD-2表达的促进作用最为明显。添加GFP融合标签的HBD-2基因的表达水平虽然略低于添加trxA融合标签的，但GFP融合标签有利于实时检测该融合蛋白的表达。在无细胞蛋白质合成系统中表达的融合蛋白可溶性高，避免了在大肠杆菌表达抗菌肽时易形成包涵体的难题。 比较了反应操作模式对无细胞系统中目标蛋白质表达水平的影响。研究表明，与间歇式操作(Batch)相比，连续交换式(CECF，Continuous Exchange Cell-free)无细胞反应方式能够明显提高目标蛋白质的表达水平，目标蛋白的表达量最高达到了2毫克/毫升。这主要是因为在CECF模式下，能够不断补充底物和能量，并同时移走抑制性副产物，从而大大延长了反应时间，提高了产物产量。对无细胞系统表达的目标蛋白质(trxA-HBD-2)的分离纯化进行了研究，建立了一条高效分离目标蛋白质的纯化工艺，总收率达到50％，目标蛋白质纯度达到95.2％。所得产物经溴化氰(CNBr)消化后，采用固体平板扩散法进行抑菌活性的测定，测得结果具有明显抑菌活性。 采用以上的无细胞表达新策略也成功地实现了HBD-3和HBD-4在无细胞系统中的高表达。这一方法对人β-防御素家族及其它阳离子抗菌肽的高效表达都具有重要的意义。论文还开展了利用无细胞蛋白质合成系统表达艾滋病病毒蛋白质新策略的研究。通过PCR的方法克隆了艾滋病病毒(HIV)生命循环周期中的16种不同蛋白质的基因，构建了用于体外表达的相应表达载体。采用两步PCR方法，构建了可以直接用于体外表达的线性模板，可用于同时快速表达16种不同基因。选取HIV病毒蛋白酶(P10)作为目标蛋白，对上述两种方法构建的表达模板在大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统中进行表达研究，结果都能检测到P10蛋白的表达，为下一步在无细胞系统中进行多基因的高通量表达和艾滋病药物筛选模型的建立奠定了基础。 论文还对大肠杆菌无细胞抽提物的制备方法进行了初步研究，自行制备了无细胞蛋白质合成系统。以GFP为报导基因，通过对大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统中抽提物的制备条件、底物配比、能量再生系统的优化，自制的无细胞蛋白质合成系统能有效地表达GFP。

目录

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摘要

前言

第一章文献综述

第二章材料与方法

第三章HBD-2表达载体的构建

第四章大肠杆菌无细胞系统间歇反应合成HBD-2

第五章大肠杆菌无细胞系统连续交换式反应合成HBD-2及产物的分离纯化

第六章大肠杆菌无细胞系统表达HBD-3，4

第七章大肠杆菌无细胞系统表达HIV病毒蛋白的初探

第八章大肠杆菌无细胞系统的构建

第九章结论和建议

致谢

发表论文及参加会议

参考文献