白菜三种雄性不育系与保持系花蕾转录组差异分析及三个花粉发育相关基因功能鉴定

摘要

利用植物雄性不育特性来选育雄性不育系是作物杂种优势利用中简化制种程序、降低制种成本的重要手段。十字花科作物是杂种优势利用最为普遍的一类作物，雄性不育系(简称不育系)是其生产一代杂种的理想系统。但植物雄性不育产生的机理极其复杂，至今尚未完全解开。花粉败育是植物雄性不育发生的表型体现，弄清花粉发育的全过程和分子机理是研究雄性不育的基础和关键所在。花粉发育涉及众多基因的表达调控，从转录组入手分析花粉发育突变体是获得花粉基因动态表达的途径之一，并可获得较大数目的花粉发育相关基因，有助于在整体水平上理解花粉发育的特征和花粉发育的分子调控机制。本文在获得共享同一保持系(核不育两用系的可育株系)的白菜(syn．B．rapa ssp．chinensis)‘矮脚黄’核不育(ajhGMS)两用系‘Bcajh97-01A/B’、‘Polima’核质互作不育(polG-CMS)系‘Bcp0197-05A’以及‘Ogura’细胞质不育(oguCMS)系‘Bcogu97-06A’材料体系的基础上，采用扩增互补脱氧核糖核酸片断长度多态性(cDNA—AFLP)及拟南芥基因芯片分析其花蕾转录组差异，对花粉基因表达谱进行系统分析，研究不同雄性不育遗传模式的基因突变导致下游系列基因表达变化的异同，为建立不同雄性不育遗传模式植物花粉基因表达谱的基本框架奠定基础，并鉴定出一批白菜花粉发育相关基因。进而采用反义RNA或RNA干涉技术，对细胞壁合成与调控相关的两个多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF2和BcMF9，以及一个未知功能的新基因BcMF10进行功能验证，从形态学、分子生物学、细胞学等方面入手鉴别三个基因在白菜花粉发育过程中的作刚机制。同时，从基因结构、表达特点、作用方式等方面，比较了白菜花粉表达的PG基因家族成员BcMF2、BcMF9和BcMF6的异同。取得的主要结果如下： (1)形态和细胞学观察发现‘Bcajh97-01A’为雄性减数分裂的胞质分裂突变体mmc，对应基因MMC可能编码特异作用于雄性减数分裂的蛋白质。形态和细胞学观察发现，ajhGMS两用系不育株系‘Bcajh97-01A’与可育株系‘Bcajh97-01B’的差异仅表现在花粉花药发育上，‘Bcajh97-01A’小孢子在减数分裂末期的胞质分裂中出现异常，不能形成胞间壁而导致四分体形成及后续的花粉发育各过程受阻，最终引起花粉败育。遗传学分析表明该不育性状由单基因位点控制，因此，‘Bcajh97-01A’实际上是一个受单基因位点控制的雄性减数分裂的胞质分裂突变体mmc，其对应基因MMC可能编码一个特异与雄性减数分裂核分裂完成后的胞质分裂相关的蛋白质。 (2)利用cDNA-AFLP技术结合拟南芥基因芯片分析白菜不同不育系之间及与其共同保持系之间的花蕾转录组差异，发现不同遗传模式不育系花蕾基因表达有相似之处，但不尽相同。利用cDNA-AFLP技术及拟南芥ATH1基因芯片，对白菜ajhGMS‘Bcajh97-01A’、DolG-CMS‘Bcpo197-05A’和oguCMS‘Bcogu97-06A’，以及它们共同的保持系‘Bcajh97-01B’进行了花蕾转录组比较分析，发现不同的不育基因作用下均引起花蕾正常转录组的巨火变化，不育基因下游众多基因的表达受到抑制，也有相当一部分的基因被激活或表达上升，但作用的不育基因不同，引起的下游基因表达变化也不尽相同。与同一保持系‘Bcajh97-01B’相比，检测到在‘Bcajh97-01A’花蕾中上调表达基因93个、下调表达基因158个：在‘Bcp0197-05A’花蕾中上调表达基因174个、下调表达基因212个；在‘Bcogu97-06A’花蕾中上调表达基因196个、下调表达基因242个。其中，在三种不育系中共同下调表达的基因有37个，上调表达的24个：‘Bcajh97-01A’和‘Bcp0197-05A’共同下调和共同下调表达的基因各5个；‘Bcajh97-01A’和‘Bcogu97-06A’共同下调表达基因为70个，共同上调表达基因9个；‘Bcp0197-05A’和‘Bcogu97-06A’共同下调表达基因70个，共同上调表达的基因45个。 (3)通过差异表达基因功能分类，发现许多花粉花药发育相关基因功能未知，白菜不同不育系与保持系的花蕾转录组差异分析扩充了植物花粉表达或特异表达基因的数目。对在三种不育系与其共同保持系花蕾转录组中检测到的差异表达基因进行功能分类，发现约50％的基因功能未知。基于三种不育系和保持系花蕾的差别仅表现在花药发育和花粉形成上，在不育系和保持系花蕾中差异表达的基因最可能与花粉花药发育相关。我们发现的这些差异表达基因在一定程度上扩充了植物花粉花药表达和特异表达基因的数目。 (4)基于基因功能分类对不同不育系与保持系花蕾基因表达差异进行的分析表明，不同遗传模式花粉花药转录组尽管具有相似的模块，但具有不同的组成特征。对差异表达基因进行功能分类发现，不育系与保持系差异表达的三组基因可分为大致相同的功能类别，但每一功能类别在每组差异基因中所占的比例不尽相同。在三种不育系花蕾中下调均较多的已知功能的基因与转运通道、蛋白质代谢、电子传递和能量途径、防卫和胁迫反应相关，上调均较多的基因与转运通道、转录调控和普通新陈代谢相关。除此之外，‘Bcajh97-01A’与‘Bcogu97-06A’在花粉花药基因表达上具有更大的共性，在两者花蕾中均下调表达的基因中，细胞壁合成与调控基因排在第一位，细胞骨架蛋白及信号转导相关基因也占了较大的比例，而转录相关基因的比例较小：两者下调表达的基因中，蛋白质代谢相关基因均比较多。‘Bcaih97-01A’与‘Bcogu97-06A’的花蕾转录组的组成特征与拟南芥花粉转录组特征较一致。相比之下，‘Bcp0197-05A’花蕾转录组的组成成分与其他两种不育系有较大的差别。 (5)时空表达模式分析发现三种不育系与其共同保持系花蕾差异表达的基因具不同的表达动态。对27条在三种不育系和保持系花蕾中差异表达的片段进行了时空表达模式分析，发现大多数差异片段所代表的基因表达在小孢子有丝分裂前后开始被检测到，在花粉成熟过程中继续积累，但在不同组织和发育阶段中的表达水平不尽相同。此外也有在花粉发育早期就检测到表达的基因。我们的研究结果证实了花粉花药发育中的基因表达调控是极其复杂的。在花粉花药发育的不同时期表达或不表达，以及表达水平有序地发生变化都是与花粉花药正常发育、实现其功能所需相对应的。 (6)表达和功能分析发现BcMF2可能是一个与花粉内壁发育相关的新PG基因。对本实验室前期从‘Bcajh97-01B’花蕾中分离得到的PG基因BcMF2进行时空表达模式分析，发现其转录本最早在四分体时期的花蕾中开始出现，随后在单核花粉粒时期的花蕾中表达量达到最高，之后，随着花粉发育的进行表达量逐渐降低直至花粉成熟，表明其属于花粉表达“早期”基因。利用反义RNA技术研究．BcMF2的功能，发现BcMF2表达受抑制的转基因植株花粉体外正常萌发率大幅度降低。约80％的花粉管生长到一定程度后顶端膨大形成泡状结构，花粉管能穿过柱头组织，但在花柱道中的生长停止。进一步观察显示转基因植株花粉畸形，萌发沟的数目及分布不规则，萌发沟在形成过程中位置和数目紊乱，花粉粒内壁异常增厚。推测BcMF2表达受抑制影响了花粉内壁中果胶的动态代谢平衡而导致萌发沟及花粉粒内壁发育的异常。BcMF2与已知的在花粉发育早期起作用的PG基因没有序列及表达特点的相似性，因此它可能是一个新的在花粉发育早期表达的PG基因。 (7)表达和功能分析发现分离获得的另一个白菜PG基因BcMF9可能参与花粉内肇和外壁的发育。分离获得在可育株‘Bcajh9701B’花蕾中特异表达的差异片段BBS13/BPO023的全长序列BcMF9，发现该基因具有典型的PG基因结构特征。分子进化分析表明其属于花粉表达或特异表达的PG基因类群。时空表达模式分析显示BcMF9属于花粉表达“晚期”基因,因其表达最早出现在四分小孢子中，在单核小孢子中开始增强，然后一直持续较高水平的表达直到花粉成熟。BcMF9的转录本亦在绒毡层中出现，从四分体时期开始直到绒毡层降解退化，一直在绒毡层细胞中维持很强的表达信号。转反义BcMF9的植株花粉离体止常萌发率明显降低，约81％的花粉萌发时花粉管爆裂。花粉管能穿过柱头组织，但不久便停止生长。扫描电镜和透射电镜观察显示，BcMF9表达受抑制产生外壁网纹浅的畸形花粉，花粉粒萌发沟处内壁增厚异常，萌发沟的位置和数目紊乱，花粉发育晚期外壁的覆盖层和基粒棒部分脱落，含油层外溢，说明BcMF9可能参与花粉壁的发育。 (8)比较分析发现PG基因家族成员BcMF2、BcMF6和BcMF9在花粉发育中可能扮演各自不同的角色。从基因序列特征、表达模式特点、基因进化关系及生物学功能等方面比较三个花粉发育相关的PG基因BcMF2、BcMF6和BcMF9的异同，发现尽管3个PG基因的表达所出现的发育阶段一致，但三者在各个发育阶段的表达量及表达变化的趋势各不相同。三者在十字花科物种中的进化特点也不完全一致。3个PG基因的表达受抑制引发了类似的结果，但并不尽相同，说明它们在花粉发育中所起的作用及作用模式可能各异。 (9)分离获得在‘Bcajh97-01B’和‘Bcp0197-05A’花蕾中高水平表达的基因BcMF10，序列特征分析提示其可能与信号转导途径相关，RNAli研究发现BcMF10表达受抑制导致花粉萌发异常。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词(Abbreviation)

声明

致谢

前言

1文献综述：十字花科植物花粉发育的分子生物学研究

1.1植物花粉发育概述

1.1.1花粉发育过程

1.1.2花粉壁发育

1.1.3花药绒毡层与花粉发育过程

1.2十字花科植物花粉发育相关基因

1.2.1与花粉发育起始相关的基因

1.2.2与减数分裂相关的基因

1.2.3与花粉有丝分裂Ⅰ相关的基因

1.2.4生殖细胞有丝分裂中的相关基因

1.3十字花科植物花粉在授粉过程中表达的基因

1.3.1花粉黏附

1.3.2花粉水合

1.3.3花粉萌发和花粉管生长

1.4十字花科植物花粉基因表达的大规模分析

1.4.1转录组分析鉴定花粉表达基因

1.4.2花粉发育基因动态表达研究

1.4.3花粉发育基因群体分析

1.5花粉壁发育相关基因的研究

1.5.1影响花粉外壁发育的基因

1.5.2影响花粉内壁发育的基因

1.5.3花粉壁中的蛋白质与花粉壁发育

1.6多聚半乳糖醛酸酶在花粉发育中的研究

1.6.1多聚半乳糖醛酸酶基因的分类、结构及表达调控

1.6.2多聚半乳糖醛酸酶基因与花粉发育

2白菜ajhGMS两用系花粉败育原因分析与polG-CMS系、oguCMS系创建

2.1材料与方法

2.1.1植物材料

2.1.2植株的形态观察与遗传分析

2.1.3花蕾的细胞学观察

2.2结果与分析

2.2.1‘Bcajh97-01A’与‘Bcajh97-01B’的差异仅表现在花粉花药发育上

2.2.2‘Bcajh97-01A’花粉败育源自小孢子减数分裂胞质分裂的异常

2.2.3创建获得‘Bcpol97-05A’和‘Bcogu97-06A’

2.3讨论

2.3.1‘Bcajh97-01A’为雄性减数分裂的胞质分裂突变体mmc

2.3.2 mmc突变体花粉败育的可能原因和发育模型

2.3.3共享保持系的多种雄性不育系是花粉发育研究的理想材料

3白菜三种雄性不育系及其保持系花蕾转录组差异的cDNA-AFLP分析

3.1材料与方法

3.1.1植物材料与主要试剂

3.1.2总RNA的提取、检测与cDNA的合成

3.1.3 cDNA-AFLP分析

3.1.4差异片段的检测、克隆和测序

3.1.5 RT-PCR

3.1.6探针标记及Northern杂交

3.2结果与分析

3.2.1提取的白菜组织总RNA及合成的cDNA质量较高

3.2.2‘Bcajh97-01A’与‘Bcajh97-01B’花蕾转录组差异的cDNA-AFLP分析

3.2.3‘Bcajh97-01A’与‘Bcajh97-01B’花蕾差异表达基因的功能分类

3.2.4‘Bcpol97-05A’、‘Bcogu97-06A’与‘Bcajh97-01B’花蕾转录组差异的cDNA-AFLP分析

3.2.5‘Bcpol97-05A’、‘Bcogu97-06A’与‘Bcajh97-01B’花蕾差异表达基因的功能分类

3.2.6比较发现三种不同雄性不育系花蕾表达基因不尽相同

3.2.7 RT-PCR分析发现差异表达片段具不同的时空表达特性

3.3讨论

3.3.1转录组分析能够探讨基因突变引起的下游基因的表达变化

3.3.2雄性不育系和保持系花蕾差异表达的片段可能代表花粉花药发育相关基因

3.3.3不同不育基因作用引起不同的花粉败育

3.3.4三种雄性不育系与其共同保持系花蕾差异表达的基因各具不同的表达动态

4白菜三种雄性不育系及其保持系花蕾转录组差异的基因芯片分析

4.1材料与方法

4.1.1植物材料

4.1.2总RAN的分离及检测

4.1.3与拟南芥基因芯片ATH1的杂交及数据处理

4.2结果与分析

4.2.1‘Bcajh97-01A’与‘Bcajh97-01B’花蕾转录组差异的基因芯片分析

4.2.2‘Bcajh97-01A’与‘Bcajh97-01B’花蕾差异表达基因的功能分类

4.2.3‘Bcpol97-05A’与‘Bcajh97-01B’花蕾转录组差异的基因芯片分析

4.2.4‘Bcpol97-05A’与‘Bcajh97-01B’花蕾差异表达基因的功能分类

4.2.5‘Bcogu97-06A’与‘Bcajh97-01B’花蕾转录组差异的基因芯片分析

4.2.6‘Bcogu97-06A’与‘Bcajh97-01B’花蕾基因表达的功能分类

4.2.7基因芯片分析三种雄性不育系花蕾转录组的异同

4.2.8基因芯片结合cDNA-AFLP技术分析三种雄性不育系与其保持系花蕾转录组差异

4.3 讨论

4.3.1利用拟南芥ATH1基因芯片分析白菜花蕾转录组是可行的

4.3.2白菜不同雄性不育遗传模式花粉基因表达相似但不尽相同

5细胞壁合成与调控相关基因在花粉发育中的功能分析：多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF2

5.1材料与方法

5.1.1植物材料与主要试剂

5.1.2基因时空表达模式分析

5.1.3反义表达载体的构建

5.1.4反义表达载体对菜心的遗传转化

5.1.5转基因植株的分子检测

5.1.6转基因植株的形态与细胞学观察

5.2结果与分析

5.2.1 BcMF2在不同发育阶段有不同的表达特点

5.2.2 BcMF2反义表达载体的构建及对农杆菌的转化

5.2.3获得反义BcMF2表达载体转化菜心植株

5.2.4转基因植株35S-bcmf2和A9-bcmf2的分子检测

5.2.5转基因植株35S-bcmf2和A9-bcmf2的形态与细胞学观察

5.3讨论

5.3.1 BcMF2是一个在花粉发育“早期”表达的PG基因

5.3.2 BcMF2表达受抑制导致花粉管顶端膨大

5.3.3 BcMF2表达受抑制影响花粉壁的发育

6细胞壁合成与调控相关基因在花粉发育中的功能分析：多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF9

6.1材料与方法

6.1.1植物材料与主要试剂

6.1.2差异片段cDNA和DNA全长的分离

6.1.3核苷酸序列分析

6.1.4基因的时空表达模式分析

6.1.5反义表达载体的构建

6.1.6反义表达载体对菜心的遗传转化

6.1.7转基因植株的分子检测

6.1.8转基因植株的形态与细胞学观察

6.2结果与分析

6.2.1获得BcMF9的cDNA和DNA全长序列

6.2.2序列特征分析表明BcMF9是一个典型的PG基因

6.2.3 BcMF9在发育中的绒毡层和小孢子中表达

6.2.4 BcMF9反义表达载体的成功构建及对农杆菌的转化

6.2.5获得BcMF9反义表达载体转化菜心植株

6.2.6转基因植株35S-bcmf9和A9-bcmf9的分子检测

6.2.7转基因植株35S-bcmf9和A9-bcmf9的形态与细胞学观察

6.3 讨论

6.3.1 BcMF9是一个典型的PG基因

6.3.2 BcMF9作用于花粉发育晚期

6.3.3 BcMF9表达受抑制导致花粉管不能正常生长

6.3.4 BcMF9与花粉壁的发育相关

6.3.5 BcMF9可能通过作用于绒毡层PCD而调控花粉壁发育

6.3.6 BcMF9可能从绒毡层分泌而来直接作用于花粉壁发育

7三个与花粉发育相关的多聚半乳糖醛酸酶基因的结构、表达及功能比较

7.1材料与方法

7.1.1实验材料

7.1.2基因时空表达模式分析

7.1.3同源基因的克隆和测序

7.1.4基因序列分析

7.1.5分子进化树构建

7.2结果与分析

7.2.1 BcMF2、BcMF6和BcMF9是不同的PG基因

7.2.2 BcMF2、BcMF6和BcMF9具有不同的时空表达特点

7.2.3 BcMF2、BcMF6和BcMF9在十字花科植物中的进化

7.3讨论

7.3.1 BcMF2、BcMF6和BcMF9可能在花粉发育中扮演不同的角色

8新基因BcMF10在花粉发育中的功能分析

8.1材料与方法

8.1.1植物材料与主要试剂

8.1.2差异片段cDNA和DNA全长的分离

8.1.3核苷酸序列分析

8.1.4基因时空表达模式分析

8.1.5 RNAi表达载体的构建

8.1.6 RNAi表达载体对菜心的遗传转化

8.1.7转基因植株的X-Gluc组织化学染色检测

8.1.8转基因植株的分子检测

8.1.9转基因植株的形态与细胞学观察

8.2结果与分析

8.2.1分离获得BcMF10的cDNA和DNA全长

8.2.2 BcMF10为具3个内含子和4个外显子的功能未知新基因

8.2.3 BcMF10是一个在花粉和绒毡层表达的基因

8.2.4构建获得BcMF10干涉基因表达载体并导入农杆菌

8.2.5获得BcMF10 RNAi表达载体转化菜心植株

8.2.6 GUS活性仅在转基因植株的花药中检测到

8.2.7转基因植株A9-bcmf10的分子检测

8.2.8转基因植株A9-bcmf10的形态与细胞学观察

8.3讨论

8.3.1 BcMF10可能与信号转导途径相关

8.3.2 BcMF10在‘Bcajh97-01B’和‘Bcpol97-05A’中具不同表达模式

8.3.3 BcMF10在花粉发育早期表达

8.3.4 BcMF10表达受抑制导致花粉萌发异常

结论

参考文献

博士在读期间发表的论文