番茄抗青枯病的AFLP分子标记及其相关基因的克隆

摘要

茄科植物细菌性青枯病是一种广泛分布于热带、亚热带和温带等温暖湿润的地区的土传性病害，是多种农作物减产的主要原因。该病可危害以茄科为主的44个科的300多种植物。我国福建、广东、台湾、广西、四川、云南、湖南、江西、浙江、上海、江苏、安徽等省市(区)都有分布。一般以番茄、马铃薯、茄子、芝麻、花生、大豆、萝卜、辣椒等茄科蔬菜以及烟草、桑、香蕉等经济作物受害较重。在番茄生长过程中经常受到青枯病的危害，特别在番茄结果期，适逢高温高湿的雨季，可引起毁灭性的危害。由于迄今尚未找到防治此病的有效方法，所以对青枯菌的致病机理和植物对此病的抗病机制的研究越来越受到人们的关注。 (1)通过测量菌株生长过程中上清液的OD值及EPSI、果胶酶和纤维素酶的变化来检测不同菌株致病力，在6个致病性力不同的菌株中筛选出了一个强致病力青枯病菌FJ，在番茄中的致病性检测表明，各菌株在致病性上存在一定差异，FJ的致病性最强，发病率达到了100％，病情指数达到了100。导致菌株致病力降低的原因是由于实验室长期保存致病力强的菌株慢慢分化为无致病力的菌株。 (2)利用筛选出的强致病力青枯菌FJ对不同番茄品种进行接菌抗病性检测，筛选到了两个感病品种T9230和T903，他们的发病率都达到100％，平均病情指数分别为98.54和91.77，二者在平均发病率上没有显著性差异，但病情指数上在0.05和0.01水平上都有显著性差异；筛选到了T9178、T0504C和T9176三个中间类型的品种，他们的平均病情指数在20-60之间；还筛选到了三个抗病品种T01254、T01028和T51A，他们的病情指数都小于20，其中T51A的抗性最强，平均病情指数为3.96。 (3)利用T51A和T9230进行杂交，对其后代植株的抗病性表现进行遗传分析，结果表明番茄植株在接菌后表现为抗病对感病为不完全显性，可能受细胞质控制遗传，受两对杂合基因控制，二者之间有互补作用。 为了寻找与抗病相关的分子标记，我们利用DNA-AELP技术和改良的DNA提取方法，选择了16条EcoRI引物和16条MseI引物相互组合，在亲本T51A和T9230间总共扩增出的条带约有19,200条，122个引物组合(占引物组合数的47.66％)在抗病亲本池(BA)和感病亲本池(BB)之间扩增出了238条差异带，平均每条引物扩增1.95条差异带。利用在两亲本池之间产生差异条带的122个引物组合在F2抗病池(BR)和)感病池(Bs)间进行筛选，只有13个引物组合在BR和Bs池间扩增到了13条差异条带，这13个引物组合在300个F2代单株中进行扩增，共找到了两个与抗病相关的分子标记(T-E2M4 和 T-E10M13)，并把序列提交到NCBI上，登陆号分别为EU260055和EU2600556，序列比对发现EU260055序列没有找到相似度较高的序列，EU260056序列与叶绿体上的rrn4.5基因有关。 根据AFLP标记T-E2M4和T-E10M13的序列设计引物，成功将AFLP标记转换为SCAR标记，利用Mapmaker/exp 3.0发现两个SCAR标记与抗病基因TRSR-1的遗传距离分别为4.6 cM和8.4 cM。 (4)我们用Trizol试剂提取RNA后利用CLONTECH公司的SMART cDNA Library Construction Kit合成cDNA，从抗病亲本T51A和感病亲本T9230中分别随机挑选10个抗病单株和10个感病单株的DNA等质量混合构建抗病亲本cDNA池(cBA)和感病亲本cDNA池(cBB)。从F2代中同样用BSA法挑选1O个高抗和高感植株的cDNA等量混合构建F2抗病池(cBR)和感病池(cBs)。四个池的cDNA用来做进一步的cDNA-AFLP分析。 通过对256对EcoRI和MseI引物组合进行转录谱AFLP分析，共检测到了约30000个清晰可见的转录基因片段，扩增片段长度大多在50-500bp。在cBA和cBR池扩增出来而在感病亲本cDNA池cBB和F2感病池cBs扩增不出来的差异片段，肉眼可分辨的有525条，对其中215条表达比较强的差异片段进行回收、克隆并测序，成功测序的有102条，经RT-PCR验证，发现11条为假阳性片段，其余的91条DE-TDFs序列经序列比对按其功能类别可以分为9类，大部分与胁迫反应(27个DE-TDFs，占29.67％)和代谢(19个DE-TDFs，占20.88％)相关，其余的为未知或假定蛋白(11个DE-TDFs)，信号转导(8个DE-TDFs)、跨膜通道(7个DE-TDFs)、Phage(3个DE-TDFs)、蛋白相互作用(4个DE-TDFs)和转录因子(2个DE-TDFs)相关，无相似序列的有7个DE-TDFs。 (5)在用引物组合E12M7进行cDNA-AFLP分析时，发现了一条长度为300bp左右的片段在抗病池中有表达，而在感病池中没有表达，这个片段长度为303 bp，将片段DE-TDF058的序列在GenBank数据库中进行比对发现与基因CCoAOMT有很高的同源性。根据马铃薯和烟草的CCoAOMT基因CDS设计引物P3/P4在番茄中进行扩增，得到了一个包括起始密码子ATG和终止密码子TAA在内的长为729 bp的序列，一共编码242个氨基酸，此全长序列已经提交到NCBI数据库中，登陆号为：EU161983，其DNA全长为816 bp，具有4个内含子，分别为23 bp，15 bp，22 bp和27 bp。将番茄CCoAOMT基因的核苷酸序列与其他茄属植物的CCoAOMT基因的核苷酸序列进行Blast比对发现，与马铃薯、烟草的CCoAOMT基因，有很高的相似度。CCoAOMT基因推导的蛋白含有Methyltransf_3保守区域，属于pfam01596，Methyltransf_3，氧甲基转移酶，可能参与抗生素的产生，细胞壁的合成，响应逆境伤害如病原菌侵染等。 根据CCoAOMT基因序列设计引物q1/q2，对番茄不同抗青枯病品种T51A、T01028、T01254和秘鲁番茄(T1364)；感病品种T9230、上海合作(Hezuo)和T9178；中间类型T9176和T0504C分别在接菌前后进行扩增。结果显示，所有品种在接菌前都能扩增到一个约730 bp的条带，接菌之后抗青枯病番茄品种都能扩增到比较强的条带，中间类型的品种扩增到的条带比较弱，感病品种不能扩增到条带。在感病品种中，接菌后可能抑制了CCoAOMT基因的表达，从而降低了木质素的合成，表现为感病。 (6)对不同抗性水平的番茄品种进行青枯菌接种试验，测定根叶中与抗病相关的PAL、SOD酶活性及生化物质木质素和总酚含量的变化，结果表明，抗病品种T51A的PAL酶活性明显高于中间类型品种T9178，T9178的PAL活性高于感病品种T9230，接菌后，各品种的PAL，活性迅速上升，其中抗病品种T51A上升的幅度最大，速度最快； 未接种各番茄品种的根部和叶片SOD活性交化幅度不大，接菌之后各品种的SOD活性均显著上升，抗病品种T51A的活性大于T9178的活性和T9230的活性，在达到最高峰后各品种的SOD活性一直下降，除T9230最后的SOD活性比对照低外，T51A和T9178最后的活性均比对照高。 未接菌的番茄品种木质素含量变化不大，但抗性高的含量比抗性低的高；接菌之后各品种的根部及叶片中的木质素含量都显著增加，但抗性高的T51A增加的最快，增加的也最多，而感病品种T9230的增幅较小，这说明木质素含量与番茄品种抗青枯病有关系。 不同抗性类型的番茄品种在接菌之后，根部和叶片中总酚含量都增加，其中抗病品种T51A的增幅最大，呈现双峰曲线，但其含量含量始终高于中间类型T9178和感病品种T9230；中间类型品种T9178的趋势同T51A，在第10天也还是高于感病品种T9230；T9230与其他品种不同的是，在前4天内根部总酚含量一直升高，然后缓慢下降，但最后其含量还是高于不接菌的品种，而且接菌后的T9230直到第3天左右才超过不接菌的T51A的总酚含量，说明T9230在总酚含量升高方面比其他品种反应迟钝些。

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声明

致谢

1文献综述

1.1植物青枯菌的研究进展

1.1.1青枯病原菌的分类及其种下分化

1.1.2青枯病病菌的致病机制

1.2番茄抗青枯病的研究进展

1.2.1番茄对青枯病的抗病机制

1.2.2抗源

1.2.3番茄青枯病抗性遗传的经典研究

1.2.4抗性的分子遗传研究

1.2.5番茄的抗青枯病育种

1.2.6青枯病的防治

1.3基因定位方法

1.3.1质量性状基因的分子定位

1.3.2 QTL定位

2青枯菌致病力检测

2.1材料与实验方法

2.1.1供试菌株

2.1.2供试番茄品种

2.1.3供试培养基

2.1.4实验方法

2.2结果与分析

2.2.1不同菌株处理番茄后的致病性比较

2.2.2青枯菌不同菌株的生理差异

2.2.3不同菌株EPS产量的比较

2.2.4果胶酶活性

2.2.5纤维素酶活性

2.3讨论

3番茄品种对青枯病的抗病性鉴定

3.1试验材料与方法

3.1.1试验材料

3.1.2抗病性鉴定

3.2结果与分析

3.3讨论

4番茄抗青枯病相关基因的分子标记

4.1材料与方法

4.1.1试验材料

4.1.2试剂

4.1.3基因组DNA的制备

4.1.4 BSA法构建DNA抗病池与感病池

4.1.5 AFLP分析

4.1.6凝胶上回收多态性DNA片段

4.1.7目的片段的克隆、测序

4.1.8差异片段测序

4.1.9标记的SCAR转化

4.2结果与分析

4.2.1番茄抗青病的遗传分析

4.2.2 DNA提取检测

4.2.3预扩和选扩产物的检测

4.2.4引物筛选及差异条带的获得

4.2.5差异条带的回收、克隆和测序

4.2.6序列比较

4.2.7 AFLP标记的SCAR转换和连锁分析

4.3讨论

4.3.1影响AFLP的因素

4.3.2差异条带太少的原因

4.3.3与抗青枯病相关的分子标记

4.3.4 AFLP分子标记的SCAR转化

5利用cDNA-AFLP技术分析青枯菌诱导的番茄抗青枯病基因表达差异

5.1材料与方法

5.1.1实验材料

5.1.2试验试剂

5.1.3总RNA提取及cDNA合成

5.1.4 cDNA-AFLP

5.1.5差异片段的回收、克隆和测序

5.1.6差异片段的RT-PCR分析

5.2结果与分析

5.2.1青枯菌诱导的番茄抗青枯病基因表达差异

5.2.2差异表达片段的分析与功能预测

5.3讨论

5.3.1基因克隆方法

5.3.2 cDNA-AFLP技术的应用

6番茄抗青枯病基因CCoAOMT的克隆、表达与序列分析

6.1材料与方法

6.1.1实验材料

6.1.2差异片段的回收、测序和CCoAOMT基因的克隆

6.1.3序列分析

6.1.4 CCoAOMT基因在不同抗病类型番茄中的表达

6.2结果与分析

6.2.1差异片段DE-TDF058的获得

6.2.2差异片段DE-TDF058的验证

6.2.3 CCoAOMT基因的克隆

6.2.4不同植物CCoAOMT基因的核苷酸序列比对

6.2.5不同植物CCoAOMT基因的氨基酸序列比对

6.2.6 CCoAOMT基因在番茄接菌前后的表达差异

6.3讨论

7番茄抗青枯病的生理生化机制

7.1试验材料与方法

7.1.1试验材料

7.1.2苯丙氨酸解氨酶(PAL)的提取及活性测定

7.1.3超氧化物岐化酶(SOD)的提取及活性测定

7.1.4木质素的提取及含量测定

7.1.5总酚的提取及含量测定

7.2结果与分析

7.2.1苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性变化

7.2.2超氧化物岐化酶(SOD)的活性变化

7.2.3木质素的变化

7.2.4根部和叶片总酚含量的变化

7.3讨论

8结论

参考文献

作者简历