苁蓉总苷和松果菊苷对体内外氧化应激阿尔茨海默病模型的作用及机理研究

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)是常发于老年人的一种痴呆性疾病，其主要病理特征为相对特异性的老年斑生成、神经元纤维缠结和神经元的丢失。研究表明，氧化应激与AD病理过程密切相关。H202或氧自由基是机体正常或异常代谢过程如β淀粉样蛋白聚集、多巴胺氧化和脑缺血再灌注的产物。生成的H2O2可以转变为高毒性的自由基攻击蛋白质、核酸和生物膜，导致线粒体损伤和钙超载等现象，诱发神经元走向凋亡。所以近年来已将氧化应激引起的神经退行性病变和细胞凋亡置于AD研究的中心位置，并将从天然产物中寻找具有抗氧化活性和抗自由基损伤的有效物质作为开发抗AD新药的重要途径。 苁蓉总苷是从管花肉苁蓉中提取得到的苯乙醇苷，苁蓉总苷胶囊由杏辉天力(杭州)药业有限公司生产，为SFDA批准的第一个以苯乙醇苷类化合物为主要成分的中药，对血管性痴呆的症状具有显著缓解作用。研究表明，苁蓉总苷具有抗氧化和神经细胞保护作用。松果菊苷是1950年第一个从狭叶紫锥菊中分离得到的苯乙醇苷类化合物，是苁蓉总苷的主要成分(含量>25％)和主要的质量控制指标，也存在于其它植物中。研究表明，松果菊苷能保护肝损伤，对TNF-α诱导的SH-SY5Y细胞凋亡和6-羟基多巴胺引起的急性大鼠纹状体细胞损伤具有一定的保护作用。但有关其体外对氧化应激所致神经细胞损伤的保护作用研究很少。 本研究拟从氧化应激的角度分别利用整体动物模型和体外细胞模型研究苁蓉总苷及其主要成分松果菊苷对氧化应激损伤的保护作用和机理，为阐明苁蓉总苷的部分作用机制和开发利用松果菊苷提供依据。具体内容和结果如下： 1.苁蓉总苷可以明显改善D-半乳糖联合亚硝酸钠所致AD小鼠的学习记忆，提高小鼠或大鼠脑内Na+-K+ATPase、GSH-Px和SOD的活性，降低NO的含量。 2.MTT法检测结果显示，松果菊苷可以明显提高H2O2损伤的PC12细胞存活率；流式细胞术和Hoechst33342染色法形态观察结果表明，松果菊苷可以显著降低H2O2损伤PC12细胞的凋亡和坏死率，改善DNA片断化和核固缩，有抗PC12细胞凋亡作用；松果菊苷可以降低H2O2损伤PC12细胞LDH的渗漏。以上实验结果提示，松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞具有明显的保护作用。 3.在H2O2损伤PC12细胞模型上，检测了Na+-K+ATPase，GSH-Px和Caspase-3三种酶活性的变化。研究发现，松果菊苷提高损伤细胞的Na+-k+ATPase，GSH-Px的活性，但降低Caspase-3的活性。 4.Rhodamine123和DCF-DA荧光染料结合流式细胞技术检测结果表明，松果菊苷可以显著升高损伤细胞的线粒体膜电位(MMP)，降低细胞内活性氧(ROS)水平。 5.Fluo-3和DAF荧光染料结合激光共聚焦检测结果显示，H2O2损伤的细胞内[Ca2+]i和NO显著升高，时程曲线上移。松果菊苷可以使损伤细胞内的[Ca2+]i和NO升高的速度和幅度都明显减缓，峰值降低。表明降低细胞内[Ca2+]i和NO与松果菊苷抑制PC12细胞凋亡的作用密切相关。 6.本实验用JC-1结合共聚焦技术进一步研究氧化损伤过程中PC12细胞MMP的变化和松果菊苷的干预作用。研究发现，用每个细胞的JC-1红色荧光强度和绿色荧光强度的比值(R)的变化值(R0/Rt)最能体现MMP的变化，未见文献报道。200μM H2O2使细胞R0/Rt变大，松果菊苷预处理使R0/Rt变小，说明MMP升高。 7.Western blot检测结果发现，氧化损伤后PC12细胞Bcl-2低表达但Bax高表达，Bax/Bcl-2升高，松果菊苷处理有效抑制了H2O2的作用，使Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表达回复到大约原来的水平，Bax/Bcl-2降低，说明抑制Bax表达和增强Bcl-2表达是松果菊苷抑制PC12细胞凋亡的重要机制之一。 8.RT-PCR半定量分析显示，PC12细胞在H2O2作用下，Bcl-2 mRNA表达显著降低，p53 mRNA、p65-2 mRNA和iNOS mRNA表达明显升高。松果菊苷可以拮抗H2O2的作用，逆转上述基因的表达，从而起到抗凋亡的作用。 本研究得出以下结论：1.苁蓉总苷可以改善D-半乳糖联合亚硝酸钠AD模型小鼠的学习记忆，部分作用机理为提高脑内Na+-K+ATPase、GSH-Px和SOD的活性，降低NO的含量。2.松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞损伤和凋亡具有明显的保护作用，升高Na+-K+ATPase,GSH-Px的活性和MMP、降低细胞内ROS、Ca2+以及NO水平、上调Bcl-2蛋白和mRNA表达但下调p53、p65和iNOS mRNA表达、降低Caspase-3的活性是其部分作用机制，说明松果菊苷通过抑制线粒体凋亡通路而发挥抗氧化应激的PC12细胞损伤作用。3.在增加其他药理实验和临床研究基础上，可以将苁蓉总苷用于其他老年性痴呆的预防和治疗；本文研究认为松果菊苷可能是治疗神经褪行性疾病如AD的有前景的候选化合物。

目录

文摘

英文文摘

致谢

第一章绪论

1.1概述

1.2AD主要病理变化

1.3AD主要临床症状

1.4 AD的发病机制学说

1.5AD的发病机制学说与氧化应激的关系

1.6 AD的治疗对策

1.7抗AD药物筛选模型

1.8本课题研究的背景

第二章苁蓉总苷和松果菊苷的药理学研究概况及本课题研究的内容和意义

2.1概述

2.2苁蓉总苷的药理学研究概况

2.3松果菊苷的药理学研究概况

2.4本课题的研究内容和意义

第三章苁蓉总苷对D-半乳糖联合亚硝酸钠所致AD小鼠学习记忆的影响和机理研究

3.1前言

3.2苁蓉总苷对D-半乳糖联合亚硝酸钠所致AD小鼠行为学的影响

3.2.1材料和方法

3.2.2实验结果

3.3.苁蓉总苷对实验性AD小鼠脑内NA+-K+ATPASE和GSH-Px的影响

3.3.1材料和方法

3.3.2实验结果

3.4苁蓉总苷对实验性AD大鼠脑内SOD和NO影响

3.4.1材料和方法

3.4.2实验结果

3.5讨论

第四章松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞的保护作用

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1实验器材、试剂

4.2.2 H2O2浓度和作用时间的选择

4.2.3松果菊苷毒性考察和浓度的选择

4.2.4MTT法测定松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞存活率的影响

4.2.5 FCM法测定松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞凋亡和坏死的影响

4.2.6Hoechst 33342染色法观察松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞凋亡的影响

4.2.7松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞LDH渗漏的影响

4.2.8数据统计分析

4.3实验结果

4.3.1不同H2O02浓度和不同的作用时间对PC12细胞活性的影响

4.3.2松果菊苷对PC12细胞毒性的考察结果

4.3.3不同剂量的松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞的保护作用

4.3.4松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞存活率的影响

4.3.5松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞凋亡和坏死的影响

4.3.6 Hoechst33342染色法观察松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞凋亡的影响

4.3.7松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞LDH渗漏的影响

4.4讨论

第五章松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞保护作用的机理研究

5.1前言

5.2材料与方法

5.2.1实验器材、试剂

5.2.2松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞相关酶活力的影响试验

5.2.3松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞Caspase-3活力的影响试验

5.2.4 FCM法测定松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞ROS的影响

5.2.5FCM法测定松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞的MMP的影响

5.2.6 LSCM法测定松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞的Ca2+、NO和MMP的影响

5.2.7Western blot测定松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞Bax／Bcl-2的影响

5.2.8 RF-PCR法检测松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞Bcl-2、p53、iNOS、NF-κBmRNA表达的影响

5.2.9数据统计分析

5.3 实验结果

5.3.1松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞Na+-K+ATPase活性的影响

5.3.2松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞GSH-PX活性的影响

5.3.3松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞Caspase-3活性的影响

5.3.4松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞内ROS的影响

5.3.5松果菊苷对H2O2损伤的PC12细胞内MMP的影响

5.3.6松果菊苷对H2O2损伤过程中PC12细胞内游离Ca2+水平变化的影响

5.3.7松果菊苷对H2O2损伤过程中PC12细胞内NO水平变化的影响

5.3.8松果菊苷对H2O2损伤过程中PC12细胞MMP变化的影响

5.3.9松果菊苷对H2O2损伤PC12细胞的Bcl-2、Bax和Bax／Bcl-2的影响

5.3.10松果菊苷对H2O2损伤PC12细胞的Bcl-2 mRNA表达的影响

5.3.11松果菊苷对H2O2损伤PC12细胞的p53 mRNA表达的影响

5.3.12松果菊苷对H2O2损伤PC12细胞的P65 mRNA表达的影响

5.3.13松果菊苷对H2O2损伤PC12细胞的iNOS mRNA表达的影响

5.4讨论

第六章总结与展望

6.1研究工作总结

6.2进一步的工作展望

参考文献

博士在读期间论文发表情况