农药残留检测的荧光和化学发光免疫分析方法研究

摘要

在课题组现有ELISA分析方法的研究基础上，进一步深化研究方法的相关影响因素，如基质效应、漂移现象及不同ELISA分析方法等。在ELISA三种包被模式研究中，结果显示包被抗体法和包被二抗法在分析方法的方法灵敏度和数据平行性方面较包被抗原法更有优势。为建立具更高灵敏度且可商品化开发的免疫分析方法，本文对时间分辨荧光分析方法(TRFIA)和化学发光酶免疫分析方法(CLEIA)进行了系统的研究。 通过对TRFIA分析方法荧光增强液中螯合剂p-NTA浓度、TOPO浓度及pH值等条件的筛选，得到了对于Eu3+和Sm3+这两种稀土离子具有良好性能的荧光增强液。在此基础上，通过对包被温度和时间、包被缓冲液、封闭物质、反应缓冲液等条件的优化。在优化基础上，建立了克百威的TRFIA分析方法并进行了标样添加回收率。结果表明，所建立的克百威TRFIA分析方法的检测灵敏度为1.86ng/mL，样品添加回收率试验表明建立的克百威TRFIA分析方法可用于样品中克百威残留检测。 通过对CLEIA化学发光增敏液中缓冲体系、发光增强剂、鲁米诺浓度及氧化剂浓度的筛选，得到具有良好性能的发光增敏液。 在此基础上，通过对化学发光板、包被温度和时间、包被缓冲液、反应缓冲液及有机溶剂与浓度等条件的优化，结果显示：Costar白色发光板的吸附效果较佳，克百威抗体选择用0.1M，pH7.2Tris-HCl液作为包被缓冲液并在并在37℃包被两小时效果为佳，封闭物质选用1％胰蛋白胨(Tyrtone)且反应缓冲液选择0.05M，pH7.2Tris-HCl液可得到最好的反应灵敏度和最大发光计数，有机溶剂中甲醇对CLEIA影响最小，反应体系中最终含量2.5％为佳。 在此基础上，建立了克百威的CLEIA分析方法，其检测限(IC10)为0.362ng/mL，检测灵敏度(IC50)为4.244ng/mL，并通过LC-MS/MS数据确证。 结果表明克百威CLEIA分析方法在灵敏度方面明显优于ELISA分析方法，并在样品检测中得到很好的应用，对多种样品的检测限已达到相关国家及CAC等设定的克百威MRL值。 在构建成功化学发光免疫分析系统基础上，进一步将CLEIA分析方法应用到三唑磷、毒死蜱和对硫磷三种有机磷农药残留分析技术中，建立的三唑磷，毒死蜱和对硫磷三种有机磷农药的CLEIA分析方法IC50值分别为0.852、21.01和2.247ng/mL，IC10值分别为0.063、0.694和0.203ng/mL。并分别与三种农药的ELISA分析方法的检测灵敏度和检测限进行比较，结果显示，CLEIA分析方法的检测限均有了较大的提高，特别是三唑磷的CLEIA分析方法，相比于ELISA分析方法其检测灵敏度和检测限提高了2个数量级，显示出CLEIA分析方法在农药残留检测方面应用的良好前景。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：术语和缩略语表

声明

致谢

第一章前言

1荧光免疫分析法

1.1荧光免疫分析

1.2时间分辨荧光免疫分析方法

1.3荧光偏振免疫测定

1.4荧光激发共振能量转移免疫分析

1.5多组分免疫分析

2发光免疫分析方法

2.1化学发光免疫分析技术的基本原理

2.2化学发光免疫分析法的类型

2.3化学发光免疫分析的联用技术

3荧光和化学发光免疫分析方法的研究进展

3.1荧光免疫分析方法的研究进展

3.2化学发光免疫分析方法的研究进展

4荧光和化学发光免疫分析方法在农药残留检测方面的应用

第二章 克百威三种ELISA方法的比较研究

1材料与方法

1.1 实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1三种ELISA方法的比较

2.2漂移现象的消除

2.3基质效应

2.4样品添加回收率测定

3小结

第三章 克百威的时间分辨荧光免疫分析研究

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1标记物的分离纯化

2.2三种标记物偶联比的计算

2.3荧光增强液的配制

2.4.TRFIA条件优化

2.5 TRFIA分析方法的确定及标准曲线回归方程的建立

2.6方法的准确性试验

2.7多组分免疫分析试验

2.8样品的添加回收率试验

3小结

第四章 克百威的化学发光酶免疫分析研究

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1化学发光增敏液的制备

2.2 CLEIA条件优化

2.3 CLEIA分析方法的确定及标准曲线回归方程的建立

2.4方法的准确性试验

2.5基质效应

2.6样品添加回收率试验

2.7样品的LC-MS／MS确证试验

3小结

第五章 化学发光酶免疫分析在有机磷农药中的比较研究

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1三唑磷CLEIA分析方法的建立

2.2对硫磷ELISA和CLEIA分析方法的建立

2.3毒死蜱ELISA和CLEIA分析方法的建立

2.4三种农药CLEIA分析方法与对应ELISA分析方法的比较

2.5样品添加回收率试验

3小结

第六章 关于农药残留检测免疫分析方法的总结和讨论

1总结

2讨论

2.1免疫分析方法条件优化

2.2漂移现象

2.3基质效应

2.4农药多残留免疫分析

2.5克百威TRFIA方法建立中存在的问题

2.6化学发光增敏液的配制

2.7 ELISA、TRFIA和CLEIA三种免疫分析方法的比较

2.8 CLEIA方法与LC-MS／MS方法的比较

2.9 CLEIA分析方法在农药残留检测中的应用前景

2.10目前农药残留检测免疫分析方法所存在的问题

3不足与展望

4本文创新点

参考文献

作者简介