蛋白酶体抑制剂(PS-341)对神经母细胞瘤的治疗作用及机制研究

摘要

目的：PS-341(又名Bortezomib或Velcade)是一类可逆的选择性蛋白酶体抑制剂，是首个由美国FDA批准用于临床多发性骨髓瘤治疗的药物。本课题主要探讨PS-341对神经母细胞瘤的治疗作用，包括PS-341诱导神经母细胞瘤细胞凋亡，以及与全反式维甲酸(ATRA)联合用于诱导神经母细胞瘤细胞的分化治疗，在此基础上，进一步研究PS-341诱导细胞凋亡以及协同ATRA诱导细胞分化的分子机制。
　　 方法：1)选用神经母细胞瘤细胞株CHP126为研究对象，用PS-341处理72h后，采用MTT法检测细胞生长情况并通过IC50计算软件计算药物作用于该细胞的IC50值；采用细胞计数板计数来检测随着药物作用时间的延长CHP126细胞的增殖情况，并描绘细胞生长曲线；细胞经碘化丙锭(P1)单染或是P1和Annexin V复染，用流式细胞分析术分析PS-341对细胞周期及凋亡的影响；采用DAPI染色来检测细胞核形态的变化；通过Western blot栓测PS-341对NFкB通路相关蛋白、p21蛋白及凋亡相关蛋白Cleaved caspase3、PARP、Bcl-2及Bax表达水平的影响；应用Real-time quantitative PCR assay检测p21 mRNA的表达水平。2)选用神经母细胞瘤细胞株CHP126及SH-SY5Y为研究对象，采用台盼兰染色法来检测上述细胞对于PS-341及ATRA的敏感性，并选取引起细胞凋亡率不高于空白对照组5％的浓度为给药浓度，将给药方式设为PS-341与ATRA单用组及两药合用组，采用细胞计数法来检测各个给药方式下神经母细胞瘤细胞的增殖情况，并描绘细胞生长曲线；同时镜下观察并记录给药后细胞的形态学变化，运用ImagePro5.0软件分析并统计细胞突触的生长情况及细胞的分化百分率；采用细胞免疫荧光、Western blot检测药物对神经母细胞瘤分化标记物Tau及β-III Tubulin蛋白表达情况的影响，并检测维甲酸相关受体RARα、RARβ及分化相关蛋白p27和JNK等蛋白的表达情况；采用原代培养新生鼠海马神经元细胞，经5 nMPS-341、20 nM PS-341、10 nM ATRA、5μM ATRA，5 nM PS-341与10 nMATRA合用处理原代神经元细胞72 h，经P1染色后用流式细胞分化术检测海马神经元细胞的凋亡情况，并进一步检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2，caspase9及caspase3的表达情况。
　　 结果：1)PS-341作用CHP126细胞72 h的IC50值为11.25 nM；用0、5、10及20 nM PS-341处理CHP126细胞24、48及72 h，细胞计数结果表明PS-341可显著抑制CHP126细胞的增殖；流式细胞术检测结果显示PS-341并不影响CHP126的细胞周期分布，但是能显著诱导CHP126细胞发生凋亡，其中5、10及20 nM PS-341作用72 h，CHP126细胞的凋亡率分别为14.6％、39.6％及58.2％，20 nM PS-341分别作用6、12、24、48和72 h后，CHP126细胞的凋亡率分别为15.3％、17.9％、18.3％及55-1％； DAPI染色结果显示，PS-341药物作用浓度的升高及药物作用时间的延长都会导致CHP126细胞核固缩的加剧及凋亡小体的增多；Western blot结果显示，PS-341作用于CHP126细胞，细胞核内NFкB(p65)及胞浆中p-IкB及IкB蛋白的表达水平没有变化，而p21蛋白和mRNA的表达水平都有较大的提高。同时，PS-341可显著抑制CHP126细胞中Bcl-2的表达，促进Bax的表达，伴随着caspase3的裂解生成Cleaved caspase3，进而促使PARP发生水解，产生85 kd的裂解片段，最终引起细胞的凋亡。2)以不同浓度的PS-341与ATRA联合应用于神经母细胞瘤CHP126及SH-SY5Y细胞72 h后，采用台盼兰染色确定细胞凋亡率，选取以引起的细胞凋亡率不高于阴性对照组5％的药物浓度为本实验的给药浓度，PS-341为5 nM，ATRA为10nM。细胞增殖实验表明PS-341与ATRA合用可显著抑制CHP126及SH-SY5Y细胞的增殖；且药物合用组引起的细胞突触的长度及细胞的分化百分率明显高于单用组，其中ATRA单用组中细胞分化百分率为28.0％，ATRA与PS-341合用组可高达50.0％：细胞免疫荧光及Western blot结果显示，PS-341单用并不会改变CHP126及SH-SY5Y细胞中Tau和β-III Tubulin的表达，ATRA单用可上调Tau和β-III Tubulin蛋白的表达水平，PS-341可协同ATRA显著上调Tau和β-IIITubulin蛋白的表达水平。另外，ATRA可引起CHP126细胞中维甲酸受体RARα蛋白表达的下降，而PS-341与ATRA合用可增进RARα蛋白的累积，同时伴随RARβ、JNK及p27蛋白表达的增加。此外，以不同浓度的PS-341与ATRA联合应用于新生鼠的海马神经元细胞，结果显示5 nM PS-341、10 nMATRA单用或者合用均不会引起海马神经元细胞的凋亡，而5μM ATRA作用72 h即可诱导24.02％的海马神经元细胞发生凋亡，20 nM PS-341引起的细胞凋亡率为58.77％；此外，20 nM PS-341作用72 h可显著上调Bax蛋白的表达，5μM ATRA及20 nM PS-341都会下调Bcl-2、caspase9及caspase3蛋白的表达。
　　 结论：通过对PS-341体外诱导神经母细胞瘤CHP126细胞凋亡及其联合ATRA诱导神经细胞瘤SH-SY5Y及CHP126细胞分化的系统研究，我们得出以下结论：1)PS-341可诱导CHP126细胞发生凋亡，其机制主要是通过上调p21和Bax的表达，抑制Bcl-2的表达水平，提高了Bax/Bcl-2的比率，从而激活caspase3发生裂解，导致PARP裂解产生85 kd的裂解片段，阻碍了细胞DNA的自我修复，最终导致细胞发生凋亡；2)PS-341可协同ATRA抑制神经母细胞瘤CHP126和SH-SY5Y细胞的增殖，并且伴随着细胞分化水平的提高；其机制可能是PS-341通过抑制RARα的降解从而增强了ATRA的疗效，并且伴随着RARβ表达水平的提高，从而促进了p27及JNK的表达，诱导了细胞的分化；原代培养的海马神经元细胞实验结果也进一步证明低浓度药物合用诱导细胞分化较药物单用诱导细胞凋亡的治疗方式，具有降低药物对于正常细胞的毒性的特性。以上研究将为临床上PS-341用于神经母细胞瘤的治疗提供实验依据。

目录

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致谢

第一部分 PS-341诱导神经母细胞瘤CHP126细胞凋亡及机制研究

1前言

2材料与方法

2.1药物与试剂

2.2仪器

2.3细胞培养

2.4 MTT法评价PS-341体外抑瘤活性

2.5细胞增殖实验

2.6流式细胞术检测细胞周期分布与凋亡

2.7 DAPI染色检测细胞核形态

2.8 Western blotting检测相关蛋白的表达

2.9 Real-time quantitative PCR检测相关基因的表达

2.10数据统计

3实验结果

3.1 PS-341对CHP126细胞增殖活性的影响

3.2 PS-341抑制CHP126细胞增殖

3.3 PS-341诱导CHP126细胞凋亡

3.4 NFκΒ通路在PS-341诱导CHP126细胞凋亡进程中的作用

3.5 p21介导PS-341诱导CHP126细胞凋亡进程

3.6线粒体通路介导PS-341诱导CHP126细胞凋亡进程

4讨论

第二部分PS-341联合ATRA诱导神经母细胞瘤细胞分化及机制研究

5前言

6材料与方法

6.1药物及试剂

6.2仪器

6.3细胞培养

6.4台盼兰拒染法确定药物对各株细胞的作用浓度

6.5细胞增殖实验及细胞形态观察

6.6细胞免疫荧光

6.7 Western blot

6.8流式细胞术测定细胞凋亡率

6.9数据统计

7实验结果

7.1台盼兰拒染确定药物对各株细胞的作用浓度

7.2 PS-341协同ATRA诱导神经母细胞瘤细胞增殖抑制

7.3 PS-341协同ATRA诱导神经母细胞瘤细胞分化

7.4 PS-341协同ATRA诱导神经母细胞瘤细胞分化标记物Tau和β-Ⅲ Tubulin表达

7.5维甲酸受体相关通路在PS-341协同ATRA诱导神经母细胞瘤CHP126细胞分化进程中的作用

7.6应用原代海马神经元细胞观察合用给药方案对正常神经元细胞的影响

8讨论

参考文献

综述：以泛素-蛋白酶体为靶向的肿瘤治疗研究进展

硕士期间发表的论文及会议摘要

作者简介