中华蜜蜂王浆抗菌肽Acc-royalisin原核表达及抑菌活性研究

摘要

中华蜜蜂(Apis cerana cerana)是我国土生土长的蜂种，其抗病性明显优于西方蜜蜂(Apismellifera)。蜂王浆是哺育工蜂的咽下腺、上颚腺和脑后腺等腺体分泌的乳状、具有生物活性的活性物质。近期的研究表明，中华蜜蜂抗病性优于西方蜜蜂以及蜂王浆不易变质的特性都与中华蜜蜂王浆抗菌肽Apis cerana cerana—royalisin(Acc—royalisin)有关。Prepro—Acc—royalisn(PPAR)是Acc—royalisin前体，Mature Acc—royalisin(MAR)为Acc—royalisin的成熟肽部分。
　　 1．Prepro—Acc—royalisn原核表达及多克隆抗体的制备
　　 以含蜂王浆抗菌肽Prepro—Acc—royalisn(PPAR)基因的中华蜜蜂头部cDNA文库质粒为模板，用PCR方法扩增出其前体片段，将该片段克隆入表达载体pGEX—4T—2，其C端与GST连接。在大肠杆菌BL21中与GST进行融合表达。利用割胶回收获得目的蛋白注射兔子，制备多克隆抗体。SDS—PAGE和薄层扫描分析结果表明：该基因得到高效表达，表达产物大小约为46kDa，占细胞总蛋白的16.3％。利用所获抗体对纯化PPAR融合蛋白进行Western blot印迹分析，获得特异性条带。结果证明，该抗体可用于检测Acc—royalisin的存在。
　　 2．Mature Acc—royalisin的原核表达及表达产物可溶性分析
　　 本试验完成了对Mature Acc—royalisin(MAR)的基因克隆、原核表达及产物的可溶性分析。Westernbolt分析结果表明MAR成功在大肠杆菌中成功的与GST进行了融合表达，表达的GST—MAR占表达总蛋白的18.6％，其中可溶性部分占90％以上。
　　 3．GST—Prepro—Acc—royalisn、GST—Acc—royalisin纯化及Acc—royalisin蛋白的获得
　　 本实验利用GenScript Corporation蛋白纯化试剂盒，将获得的GST—PPAR及GST—MAR的基因表达产物进行纯化，分别在500mL的菌液中纯化出0.0134g及and0.0206g蛋白。Westernbolt印迹表明，纯化的三种蛋白GST—PPAR、GST—MAR和GST均对GST一抗产生了很强的特异性的反应，证明GST—PPAR、GST—MAR融合蛋白纯化成功。同时，将纯化后的GST—MAR用凝血酶酶切获得了单体MAR。
　　 4．Acc—royalisin重组表达产物对革兰氏阳性细菌的抑菌活性研究
　　 用GST—PPAR，PPAR及MAR的纯化产物分别对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，黄色微球菌Micrococcus luteus和枯草芽孢杆菌Bacillus subalis．进行了抑菌试验，结果表明：三种纯化产物对这三类革兰氏阳性菌均有拮抗作用，且效果明显，与属于具有防腐功能的商品化食品添加剂—抗菌肽Nisin的具有类似的抑菌效果。这三中产物的活性强度依此为：MAR＞GST—MAR＞GST—MAR。
　　 本研究克隆和分析了中华蜜蜂王浆抗菌肽Acc—royalisin的编码序列，在世界上首次将其进行原核表达。表达产物抑菌活性分析表明，经原核表达的Acc—royalisin蛋白对革兰氏阳性菌有抑制作用，且效果明显。预期可应用于医药及食品防腐领域。

目录

文摘

英文文摘

声明

第Ⅰ部分文献综述

第一章抗菌肽的研究进展

1.抗菌肽的起源及分布

2.抗菌肽的理化性质及作用机理

3.抗菌肽的分类

4.抗菌肽的应用及前景

第二章来源于蜜蜂的抗菌肽研究进展

1.蜜蜂血淋巴中的抗菌肽

2.蜂王浆中的抗菌肽

第Ⅱ部分研究背景、主要研究内容和技术路线

第三章立题依据、研究内容和技术路线

1.选题依据及研究目的意义

2.主要研究内容

3.研究的技术路线

第Ⅲ部分研究内容

第四章Prepro-Acc-royalisin原核表达及多克隆抗体的制备

1.研究材料

2.研究方法

3结果

4.讨论

第五章Mature-Acc-royalisin原核表达及表达产物可溶性分析

1研究方法

2.结果

3.讨论

第六章GST-Prepro-Acc-royalisin、GST-Acc-royalisin的纯化及Acc-royalisin的分离

1.试剂

2.研究方法

3.结果

4.讨论

第七章Acc-royalisn重组表达产物的抑菌活性研究

1.材料与方法

2结果

3.讨论

第八章主要结论

1.主要创新点

2.本研究的主要成果及应用前景

3.今后研究的方向

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间论文及专利发表情况