蕃茄黄化曲叶病毒和黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体的制备及其检测应用

摘要

以抗体为核心建立的血清学方法用于植物病毒的检测具有操作方便、快捷、灵敏以及高通量等优点,但国内制备的植物病毒抗体并不多,大多数重要植物病毒的检测得依赖进口的抗体或者试剂盒。因此,制备重要植物病毒的特异性抗体、建立相应的血清学检测方法对植物病毒的检测及口岸检验检疫和防治具有重要意义。番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellow leaf curl virus,TYLCV)是严重危害番茄生产的双生病毒之一,而黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaicvirus,CGMMV)是我国近年来葫芦科作物上发生的又一重要的检疫性病毒。本论文分别制备了抗TYLCV和CGMMV的特异性单克隆抗体(Monoclonalantibodies,MAbs),并建立了相应的的血清学检测方法。
　　 (1)抗TYLCV单克隆抗体制备及其检测应用:用PCR方法从感染TYLCV上海分离物(TYLCV-SH2)的番茄基因组中克隆了该病毒的外壳蛋白(Coatprotein,CP)基因,将其插入到原核表达载体pET-32a中构建成重组原核表达载体。重组表达载体pET-32a-CP转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,Ni+-NTA亲和柱纯化获得分子量约为48 kDa的融合蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,获得3株能稳定传代并分泌抗TYLCV的单克隆抗体杂交瘤细胞。单克隆抗体的特异性检测表明3株单抗中3E10能与4种侵染番茄的双生病毒反应,而另外2株(282和2E3)能特异性识别TYLCV-SH2。利用单抗3E10建立了三抗夹心ELISA检测TYLCV的方法,该方法检测病叶的灵敏度可达1:2560(w/v,g/mL),对田间样品的检测表明,TYLCV在田间番茄植物上发病普遍。
　　 (2)抗CGMMV单抗制备及其检测应用:用提纯的CGMMV病毒粒子免疫的BALB/c鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经细胞筛选与克隆,获得6株能稳定传代并分泌抗CGMMV单克隆抗体的杂交瘤细胞,并分别制备其单抗腹水。其中单抗5D11可以与CGMMV、烟草花叶病毒(TMV)和番茄花叶病毒(ToMV)3种烟草花叶病毒属的病毒反应,单抗8E3和11812除与CGMMV有强阳性反应外,与TMV和ToMV存在较弱的反应,而单抗4H1、5810和11A4仅与CGMMV有特异性反应。利用最灵敏的4H1单抗为核心建立了检测CGMMV的抗原包被间接ELISA方法(Antigen-coated plate enzyme-linked immunosorbentassay,ACP-EIASA)、免疫斑点法(Dot-blot ELISA)、组织印迹法(Tissue-blotELISA)和免疫捕获RT-PCR(Immunocapture reverse transcriptase polymerase chainreaction,IC-RT-PCR)。建立的ACP-ELISA和Dot-blot ELISA方法检测感染CGMMV的黄瓜植株组织的灵敏度分别高达1:40960和1:20480(w/v,g/mL)。Tissue-blot ELISA操作简便,尤其适合大规模的田间样品检测和诊断。IC-RT-PCR具有最高的检测灵敏度和特异性,对提纯的病毒检出量达到了0.1 Pg,对感病植物组织的检测灵敏度为1:102400(w/v,g/mL)。

目录

文摘

英文文摘

致谢

第一章 文献综述

1 番茄黄化曲叶病毒研究进展

1.1 寄主范围、症状和分布

1.2 分子生物学特性

1.3 TYLCV检测技术

1.4 防治策略

2 黄瓜绿斑驳花叶病毒研究进展

2.1 生物学特性

2.2 基因组结构及功能

2.3 病毒株系组成与血清学关系

2.4 CGMMV检测技术的发展

3 单克隆抗体技术及其在植物病毒学中的应用

3.1 抗体的基本结构及其特性

3.2 单克隆抗体技术

3.3 单克隆抗体在植物病毒学中的应用

第二章 番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备和应用

1 材料与方法

1.1 病毒

1.2 菌株和质粒

1.3 试剂

1.4 TYLCV CP基因克隆及其原核表达载体的构建

1.5 TYLCV CP基因在大肠杆菌中的表达及蛋白纯化

1.6 多克隆抗体和单克隆抗体的制备

1.7 用制备的抗体建立测定TYLCV的酶联免疫吸附测定法(ELISA)

2 结果与分析

2.1 TYLCV-SH2外壳蛋白基因的克隆和原核表达载体的构建

2.2 TYLCV-SH2外壳蛋白的原核表达与纯化

2.3 重组蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

2.4 抗TYLCV-SH2 CP单克隆抗体的特性

2.5 TAS-EIASA和Western blot检测抗体特异性

2.6 TAS-ELISA检测方法的建立

2.7 TAS-ELISA田间检测应用

3 讨论

第三章 黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体的制备

1 材料和方法

1.1 病毒、培养基和抗体

1.2 黄瓜绿斑驳花叶病毒的提纯

1.3 单克隆抗体的制备

1.4 腹水制备、抗体纯化、抗体类型及亚类鉴定和腹水效价测定

1.5 Western blot检测

1.6 CGMMV的ACP-ELISA检测方法

1.7 Dot-blot ELISA和Tissue-blot ELISA的建立及检测应用

1.8 IC-RT-PCR的建立及应用

2 结果与分析

2.1 黄瓜绿斑驳花叶病毒的提纯及抗原制备

2.2 杂交瘤细胞的融合、筛选和克隆

2.3 腹水抗体制备、效价测定及抗体亚类鉴定

2.4 Western blot分析

2.5 单抗的特异性和灵敏度

2.6 ACP-ELISA检测方法建立和应用

2.7 Dot-blot ELIsA和Tissue-blot ELIsA的建立及检测应用

2.8 IC-RT-PCR的建立及应用

3 讨论

参考文献

附录A 常用生化及分子生物学试剂与仪器

附录B 常用缓冲液及培养基配方

在学期间所取得的科研成果