肿瘤抑制基因CADM1在肝癌中的表达调控及其功能研究

摘要

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见恶性肿瘤之一,在世界范围内肿瘤致死原因排第3位,导致每年约60万人死亡。我国是个乙肝大国,乙肝病毒携带率在国民中很高。作为肝炎-肝硬化-肝癌这一发展链的终末端,肝癌在我国的高发成为无可争辩的事实,从而使我国成为全世界肝癌的最高发地区之一。与肝癌发生相关的主要危险因素有酗酒、黄曲霉素摄入、HBV感染和HCV感染等。随着人类基因组学的长足发展和对肿瘤认识的不断深入,人们意识到肿瘤发生发展是个极其复杂的过程,众多基因的变化和表观遗传学等的改变涉及其中。综合目前对肝癌的研究进展,我们尚不能对其发生发展的分子机制做出科学合理的解释。所以对肝癌形成发展机制的深入挖掘,鉴定并发展肝癌治疗的新靶标具有重要的意义。
　　 随着外科技术的发展,肝移植已经被人们接受成为治愈肝癌的最好治疗方案之一,但是部分病人肝移植后肝癌复发的现实依旧成为制约受者长期存活的瓶颈因素。应用理想生物指标将患者进行分类,可帮助临床医生鉴定出术后易转移复发病例,并提供个性化的干预治疗,以改善病人的预后。围绕肿瘤复发转移这一热点问题,大量预测肝癌复发的生物学标记鉴定研究已经开展,到目前为止,尚未发现能够广泛应用于临床的可靠的预后预测指标。
　　 表观遗传学的改变是参与肿瘤发生发展中的一个重要事件。作为表观遗传学的重要研究内容,DNA甲基化导致肿瘤抑制基因的失活被认为是导致肿瘤发生的早期机制之一。肿瘤抑制基因启动子区CpG岛的甲基化在肿瘤细胞的生长、细胞黏附、细胞凋亡、DAN修复和肿瘤血管生成等的过程中发挥重要的作用。近年来大量的研究报道了DNA甲基化在肿瘤患者预后中的预测作用,其作为一类生物标记已显示出良好的应用前景。细胞黏附分子1(Cell adhesion molecule l,CADM1)是最近通过功能互补试验而在人类非小细胞肺癌中鉴定为肿瘤抑制基因。大量的证据表明CADM1参与了人类众多肿瘤的形成与发展。在本课题中,我们首次检测了CADM1在肝癌中的表达,探讨影响其表达的调控机制,尝试揭示其肿瘤抑制的可能机制,最后评估其在肝移植术后肝癌复发预测中的价值。
　　 第一部分肿瘤抑制基因CADM1的表达调控及启动子区DNA甲基化对肝移植后肝癌复发预测的价值研究。
　　 目的:
　　 肝移植是肝癌患者最佳治疗选择之一,但大约20％-40％的患者在移植5年内会经历肝癌的复发。目前尚无可靠的生物学标记可以做出分类,筛选出高危易复发病例。本实验的目的是检测CADM1在肝癌细胞株和临床标本中的表达,尝试阐述影响其表达的分子机制；同时检测肝癌细胞株和临床标本中CADM1启动子区甲基化的状态,并评估其在肝移植后肝癌复发预测中的价值。
　　 方法:
　　 应用RT-PCR和免疫组化(immunollistochemistry,IHC)方法检测CADM1在肝癌细胞株和临床标本中mRNA和蛋白水平的表达情况。RT-PCR检测甲基化酶抑制剂(5’-Aza-dC)用药前后肝癌细胞株中CADM1的mRNA表达水平；并应用基因扫描检测肝癌临床标本中的杂合性缺失(Loss of heterozygosity,LOH)情况,探讨影响其表达的调控机制。采用重亚硫酸氢盐修饰测序PCR(Bisulfite sequencingPolymerase Chain Reaction,BSP)的方法首先检测10株肝癌细胞株和2株永生化正常肝细胞株中CADM1基因甲基化状况,之后通过双荧光素酶报告系统结合定点突变技术确定CADM1基因的核心启动子区,针对该区域采用结合重亚硫酸氢盐的限制性内切酶法(COBRA)检测了82对临床肝癌组织中CADM1的甲基化状态。最后收集肝癌肝移植病人临床病理资料及随访资料,比较不同CADM1甲基化表型与病人临床病理指标及移植术后复发生存之间的关系。
　　 结果:
　　 CADM1异常甲基化在肝癌细胞株中发生的比例为50％(5／10),同时常伴有mRNA表达水平下降。应用甲基化酶抑制剂5’-Aza-dC作用肝癌细胞株后,CADM1的表达得到恢复或明显增强。LOH在肝癌组织中的发生比例为13.8％(4／29)。CADM1的核心启动子序列位于转录起始位点前-146 bp至-226 bp,位于该区域中的Sp1结合元件在CADM1基因的转录过程中可能发挥重要的作用。针对该区域的甲基化检测发现,CADM1甲基化在临床肝癌标本中的发生率为41.5％(34／82)。CADM1异常甲基化病例移植后肿瘤复发的发生概率明显高于非甲基化病例(70.6％versus33.3％；P=0.001)。多因素分析提示CADM1甲基化是肝癌肝移植术后肿瘤复发的独立危险因素(HR=2.788；95％CI,1.043-5.063；P=0.010)。
　　 结论:
　　 在肝癌中,启动子区DNA甲基化是导致CADM1表达下调的主要调控机制。CADM1启动子区甲基化是影响移植后肝癌复发的独立危险因素,对移植后肿瘤复发的预测具有潜在的重要价值。
　　 第二部分肿瘤抑制基因CADM1在肝细胞肝癌中的抑癌作用及其机制的实验研究。
　　 目的:
　　 随着对CADM1基因研究的深入开展,越来越多的证据显示它和多数的人类肿瘤形成相关。在本课题中我们应用了一系列的细胞生物学实验来验证CADM1在肝癌形成发展中的作用,并分别采用体外和体内的实验方法尝试阐述CADM1在肝癌中作为肿瘤抑制基因的潜在机制。
　　 方法:
　　 为了评估CADM1在肝癌形成发展中的作用,我们首先成功构建了该基因的真核表达载体,之后采用了一系列的细胞学功能实验方法,包括CCK-8增殖抑制实验、EdU掺入增殖实验、细胞周期实验、克隆形成实验和裸鼠体内肿瘤形成实验。最后应用Western blot和siRNA等实验方法对CADM1的肿瘤抑制作用的潜在机制作出探讨。
　　 结果:
　　 应用克隆技术,我们成功构建了CADM1的真核表达载体。在低表达CADM1的肝癌细胞株HepG2和MHCC-97L中,异位表达的CADM1显著抑制了肿瘤细胞的增殖,并使细胞增殖停滞于G0／G1期。同时,异位表达的CADM1明显抑制了肿瘤细胞体外形成克隆的能力；在体内,稳定转染CADM1表达载体的MHCC-97L细胞种植的裸鼠皮下肿瘤形成数目明显低于空载体组(4／8 versus8／8)。Western blot实验结果显示,Rb蛋白的表达丰度随着CADM1的表达量的上调而增加,同时在临床肝癌标本中CADM1蛋白的表达与Rb蛋白的表达显示出较为明显的一致性。在高表达CADM1蛋白的BEL-7402细胞中,我们应用siRNA敲除技术后发现,CADM1蛋白沉默同时也伴有Rb蛋白表达的下调。
　　 结论:
　　 在肝癌中,CADM1蛋白表达普遍下调。异位表达的CADM1蛋白可明显抑制肝癌细胞的生长和体内肿瘤的形成,其肿瘤抑制的潜在机制可能是通过上调Rb蛋白从而调节Rb-E2F通路实现。